大叶补血草耐盐基因LgNHX1的克隆、遗传转化及功能初步研究

摘要

土壤盐渍化是全球农业最严重的问题之一。中国的干旱区面积占全国总面积的1/3，土壤的盐渍化问题和灌溉引起的土壤次生盐渍化问题是制约干旱区农业发展的主要障碍，也是影响生态环境稳定的重要因素。因此，提高植物特别是作物的耐盐性是开发和利用盐渍土地最有效的方法之一。大叶补血草是新疆的特有植物，其群落生境土壤多为草甸盐土，在长期的自然选择进化中，大叶补血草形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应特定盐碱条件的生理和生化机制。因此，研究大叶补血草的耐盐相关基因，具有重要的理论和实际意义。NHX1是液泡膜中的一种Na+/H+逆向转运蛋白，可促进钠离子在液泡中的区隔化效应（跨液泡膜的pH为其提供能量），避免细胞质中的高Na+盐毒害，维持高的K+/Na+比，达到离子平衡和渗透平衡。钠离子和氯离子区隔化在液泡中，不仅可作为有效的渗透调节剂，还可减小细胞毒性，从而提高植物的耐盐能力，解决植物生长受抑制等问题。 本研究根据农业生物技术重点实验室克隆的大叶补血草Na+/H+逆向转运蛋白LgNHX1的cDNA编码序列设计特异性引物，利用RT-PCR的方法克隆了大叶补血草LgNHX1编码区。其编码区长度为1656bp，编码551个氨基酸。蛋白疏水性分析表明，LgNHX1高度疏水，跨膜域分析表明LgNHX1含有12个跨膜域，为跨膜蛋白。采用常规分子克隆技术，构建了LgNHX1基因的原核表达载体pET28a-N1、pET32a-N1、pET28a-N2、pET32a-N2。重组质粒转化大肠杆菌感受态BL21，IPTG诱导蛋白表达。构建植物表达载体pCAMBIA1301-LgNHX1。重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101，转化烟草、番茄，经不定芽诱导、生根培养，获得转基因烟草和番茄植株。转基因植株经潮霉素检测、PCR、RT-PCR检测、初步表明目的基因已整合到烟草和番茄基因组中，并可以正常转录。通过组织培养扩繁，得到转LgNHX1基因烟草的4个克隆群体，并对其和未转基因烟草同时进行盐胁迫2周，结果显示，相同NaCl浓度胁迫下，转基因烟草的叶绿素含量较未转基因烟草高，而丙二醛含量和细胞膜透性较未转基因烟草低。说明LgNHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的耐盐性。本研究不仅为大叶补血草Na+/H+逆向转运蛋白基因LgNHX1的进一步功能分析和应用奠定了一定的理论基础，还为将大叶补血草作为一种种质资源应用于植物耐盐基因工程提供了一定的实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩略词表

声明

前言

第一章文献综述

1盐胁迫对植物的影响

2植物的耐盐机理

3 Na+/H+逆向转运蛋白研究进展

4展望

第二章实验材料和方法

1实验材料

2实验方法

第三章实验结果与分析

1大叶补血草LgNHX1基因的获得

2大叶补血草LgNHX1基因原核表达载体构建

3大叶补血草LgNHX1基因植物表达载体构建

4根癌农杆菌介导的烟草的转化和再生

5转基因烟草的鉴定

6转基因烟草的耐盐性检测

7根癌农杆菌介导的番茄的转化和再生

第四章结论

第五章讨论

1大叶补血草LgNHX1基因的原核表达

2载体构建中同尾酶的应用

3转大叶补血草LgNHX1基因烟草的耐盐性

4农杆菌介导的番茄转化的研究

第六章进一步实验设想

参考文献

致谢

附 录

作者简介