布鲁氏菌疫苗株流产相关因子Omp25蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究

摘要

布鲁氏菌病（brucellosis）(以下简称布病)是由布鲁氏菌（brucella）引起的人、畜共患传染病，广泛分布于世界各地。布鲁氏菌病对我国经济建设、人民健康生活、国家安全等存在着严重的威胁。
　　 布病的病原为布鲁氏菌，是一种胞内寄生菌。它的致病机制以胞内生存为主要特征。
　　 研究表明，动物胎盘是布鲁氏菌生存、繁殖的嗜好区域之一。胚胎滋养层细胞是布鲁氏菌感染的靶细胞，一旦被破坏，容易引起流产，但是其分子机制目前还不清楚。因此，以布鲁氏菌和胚胎滋养层细胞为研究对象具有重要意义。本研究主要包括以下几方面内容：
　　 ⑴流产布鲁氏菌S19 omp25基因Bait载体的构建及鉴定。通过对流产布鲁氏菌S19 omp25基因进行克隆、连接、酶切、纯化等实验，构建重组质粒pGBKT7-omp25并将其转化到酿酒酵母Y187 中，通过酵母自激活实验和毒性实验检测转化子酿酒酵母Y187（pGBKT7-omp25）的构建。经PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体，获得的转化子酵母Y187 菌株无自激活活性，无毒性。
　　 ⑵流产布鲁氏菌S19 侵染TGC细胞后提取总RNA 构建cDNA 文库。首先用布鲁氏菌S19 侵染牛胚胎滋养层细胞（TGC）3.5h 后提取Total RNA,用试剂盒逆转录形成cDNA,采用同源重组技术构建布鲁氏菌S19 侵染TGC细胞的cDNA文库，即pGADT7-cDNA 并将其转化到酿酒酵母AH109中，经鉴定，cDNA文库库容为1.30×106，重组效率为96.0％，插入片段大小在0.2-2.0kb之间。
　　 ⑶酵母双杂交实验。应用酵母双杂交技术，将酿酒酵母AH109（pGADT7-cDNA）和Y187（pGBKT7-omp25）进行杂交并将阳性杂交子进行摇菌、提质粒、转化DH5α、PCR等实验鉴定。最后送交测序并对测序结果进行分析。测序结果表明，筛选出与流产布鲁氏菌流产相关因子Omp25相互作用的TGC细胞的靶蛋白共16个。
　　 ⑷Q-RT-PCR实验。通过上述实验获得16个蛋白基因序列，对其中2个基因设计引物，检测两种特异结合蛋白的mRNA的增减规律，进一步分析与S19、RB51的Omp25蛋白相互作用的滋养层细胞靶蛋白。结果表明RB51 侵染TGC细胞后，TMED1和clusterin基因的量均增加，而S19 侵染TGC细胞后，TMED1基因增加，clusterin基因的量降低。
　　 以上实验结果证明，成功地构建了流产布鲁氏菌S19 omp25基因Bait 载体；成功构建了流产布鲁氏菌S19 侵染TGC细胞的cDNA 文库；酵母双杂交筛选出流产布鲁氏菌OMP25蛋白与TGC细胞相互作用的16个蛋白，并对TMED1基因和clusterin基因进行Q-RT-PCR 分析。通过本实验，为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。