布鲁氏菌VirB4蛋白与宿主胚胎滋养细胞相互作用的研究

摘要

布鲁氏菌病在世界上的多个国家和地区都是一个无法彻底解决的难题，每年人病发案例超过50万，不仅对人民的身体健康构成威胁，也给畜牧业的发展造成了不可估量的损失。研究表明布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统家族蛋白与布鲁氏菌的侵染、胞内生存、繁殖有直接关系，是布鲁氏菌重要的毒力因子。因此，探索Ⅳ型分泌系统的毒力因子和滋养层细胞靶蛋白的结合机制，对于布鲁氏菌病的控制有着重要的意义。
　　 首先，对新疆省布鲁氏菌病的流行情况进行了调查。从省内27个地区采集家畜样品1859份进行了琥红平板初检和试管凝集试验复检，其中羊血清1425份、牛血清434份。结果显示：阳性率都比较高，最高达31.51％，羊感染率平均为8.42％，牛感染率平均为6.68％。表明了布鲁氏菌病在这些地区的发生率比较高，这也和当前世界布鲁氏菌病的流行状况一致。
　　 其次，采用酵母双杂交技术筛选分析由RB51侵染后的滋养层细胞内与virB4特异结合的靶蛋白，并采用荧光实时定量技术检测靶蛋白的表达量。设计引物扩增疫苗株RB51的virB4基因，通过连接克隆载体，测序鉴定，NdeⅠ/PstⅠ双酶切，连接表达载体pGBKT7，酶切鉴定，测序分析正确后，转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187，进行自激活和毒性检测，构建诱饵质粒；建立牛胚胎滋养层细胞培养模型，构建RB51侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库。利用所构建的诱饵采用酵母双杂交筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白，实时定量检测与virB4特异结合的靶蛋白的表达量的变化。结果：成功构建了包含pGBKT7-virB4诱饵质粒的Y187表达载体。成功建立了布鲁氏菌RB51侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库。酵母双杂交筛选到了13个阳性质粒，对特异结合的蛋白辅酶Q10和SLC3A2进行实时定量PCR检测结果表明侵染后二者的表达量均增加了。辅酶Q10的增加可能会使细胞的新陈代谢加强。SLC3A2的增加会使氨基酸的转运功能发生改变。本试验对virB4的研究结果为探索布病病致病机理提供了一定的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

课题来源

英文缩略词表

引言

第一章 文献综述

1 布鲁氏菌的病原学特征

2 布鲁氏菌的流行现状

3 布鲁氏菌的致病性

4 Ⅳ型分泌系统

5 研究现状

参考文献

第二章 试验研究

实验一 新疆布鲁氏菌病血清学检测

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

实验二 布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养细胞cDNA文库的构建

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

实验三 布鲁氏菌virB4基因酵母表达载体的构建

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

实验四 利用酵母双杂交系统筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞靶蛋白

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

实验五 特异结合蛋白辅酶Q10和SLC3A2的mRNA表达检测

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

结论

创新点

附 录

致谢

作者简介

附件