金黄色葡萄球菌保护性抗原基因重组牛痘病毒的构建与鉴定研究

摘要

金黄色葡萄球菌是一种能感染多种动物的常见革兰氏阳性球菌。病原学调查表明，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原之一，对奶牛养殖业的危害较重。为了有效预防奶牛乳房炎的发生，目前迫切需要研究有效的金黄色葡萄球菌疫苗。为此，本项目开展了以下研究工作：
　　 1.致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌SHZ1株保护性抗原基因的克隆与序列分析：利用PCR技术从致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌SHZ1株基因组中扩增出FnBP基因和ClfA基因，克隆至T载体并进行测序。结果表明，金黄色葡萄球菌SHZ1株FnBP基因与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌FnBP（序列号为EF127872）的核苷酸序列同源性为99.86％。核苷酸序列中有两个碱基发生变异，但均为同义突变。金黄色葡萄球菌SHZ1株ClfA基因与Genbank上公布的金黄色葡萄球菌ClfA（序列号为EF207779）的核苷酸序列同源性为96％，氨基酸序列的同源性为100％。
　　 2.金黄色葡萄球菌FnBP基因重组牛痘病毒的构建、鉴定与纯化研究：将用SamⅠ单酶切将目的基因切下，并克隆至pSC11牛痘病毒载体，测序鉴定正向连接的阳性克隆。选择正向连接的重组转移质粒pSC11-FnBP，利用脂质体转染法将重组转移质粒转染已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21细胞中，收获转染产物，并反复冻融，然后充分稀释接种BHK-21细胞，利用蓝白斑筛选重组牛痘病毒，连续传代纯化蓝色蚀斑，结果传代5次后得到较纯的重组牛痘病毒。利用PCR技术、RT-PCR技术及Western-blotting检测经纯化后得到的重组牛痘病毒，证实外源基因FnBP已成功重组到牛痘弱毒株病毒基因组中，并随着牛痘弱毒株病毒在BHK-21细胞内的生长、繁殖而复制、转录和翻译。
　　 3.金黄色葡萄球菌FnBP基因重组牛痘病毒的生长特性、安全性及免疫原性初步研究；利用BHK-21细胞测定非重组牛痘病毒与重组牛痘病毒的毒价（TCID50），结果表明重组外源基因的重组牛痘病毒与非重组牛痘病毒的毒价相比并没有降低。重组牛痘病毒pSC11-FnBP作为实验组，生理盐水和牛痘弱毒株病毒作为对照组，对小鼠进行了实验免疫研究。通过对免疫小鼠体征及内脏器官进行病理切片观察，结果证实重组牛痘病毒pSC11-FnBP对免疫小鼠无任何不良反应，具有良好的安全性。通过检测重组牛痘病毒免疫小鼠血清中IFN-γ和测定中性粒细胞吞噬功能证实构建的重组牛痘病毒与牛痘弱毒株病毒相比可诱导机体产生较好的细胞免疫。攻毒试验表明，重组牛痘病毒对金黄色葡萄球菌具有一定的免疫保护作用。本研究为金黄色葡萄球菌新型疫苗的研究奠定了一定的基础，同时也为奶牛乳房炎的免疫防控研究提供一个新的思路。