新疆吐鲁番地区土壤细菌16SrDNA文库构建及纤维素酶基因的克隆与表达研究

摘要

土壤是微生物生长的主要场所，富含其生长的所有营养物质，是微生物生长的大本营。不同的营养环境适合于不同的微生物生长。极端环境土壤微生物的群落结构和多样性研究是了解土壤生态系统的必要条件。纤维素的降解是由纤维素酶的水解作用进行将其分解成单糖葡萄糖和纤维二糖及寡聚糖，再次生成乙醇等生物能源物质。从而将自然界的产物木质素得到最大限度的利用，防止资源的浪费。本文从土壤采样、DNA的提取、微生物多样性分析、纤维素酶生产菌的分离和筛选、混合发酵产纤维素酶的酶学性质研究，混合发酵培养条件的优化，纤维素酶基因的克隆和表达等方面进行研究，为极端环境下纤维素酶生产菌株的一系列研究做出理论基础。试验研究内容如下：
　　1采集新疆吐鲁番地区土壤，用不同的提取方法得到土壤微生物总DNA，其中Martin法和高盐改进法所得DNA浓度和纯度均较本试验改进法和试剂盒法低，本试验改进方法所提DNA的浓度最大为63.6 ng/ul，土壤微生物DNA强力提取试剂盒所提DNA纯度最大为A260/A280=1.82。改进方法与试剂盒提取所得DNA均能用于土壤微生物群落结构和多样性的研究分析。
　　2将采集的样品进行菌株的分离计数，土壤理化性质的测定，细菌数为3.03*103，土壤含盐量为6.93g/kg，pH值为7.81，属于盐碱土壤。采用未培养技术直接提取土壤细菌总DNA和可培养平板细菌DNA，分别构建基于细菌通用引物扩增的16SrDNA基因克隆文库，通过限制性酶对两文库中的克隆进行酶切分析，通过构建两种细菌文库的系统发育树，并分析主要群落的组成，表明该地区的可培养细菌多样性较低，主要类群为芽孢杆菌属和假单胞菌属，这可能与土壤基质和环境有关。对土壤总细菌克隆文库进行酶切和鉴定分析，酶切片段多态性高，且绝大多数为不可培养微生物。
　　3从可培养细菌群中通过初筛和复筛分离筛选得到11株产纤维素酶菌株。通过酶活测定得到一株酶活最高菌株C-6，经过生理生化和分子鉴定该菌株为芽孢杆菌Bacillus tequilensis strain C-6。发酵试验时间为4d时，酶液中各组分酶活力均最高，酶的最适反应温度为50℃，最适反应 pH为7，所产酶为中性耐高温酶，对工业生产酶的利用提供理论基础。
　　4纤维素酶是一种复合诱导酶，中间产物会对纤维素酶的水解过程起反馈抑制的作用，试验将产酶菌株与酵母菌混合发酵培养，进行酶学性质研究。研究结果表明：酵母菌的最佳接入时间为24h，接入酵母发酵培养4d时，β-G酶活达到最大，混合发酵5d时 FPase和CMCase酶活达到最大。最佳混合培养温度为32℃，最佳培养 pH为5，盐浓度为2％-4％时具有较高的酶活力。葡萄糖、甘油和木糖对酶活均有抑制作用，随着浓度的增加酶活逐渐降低。一些金属离子，表面活性剂和有机溶剂对酶活有抑制或激活作用。发酵粗酶液的(NH4)2SO4最佳盐析浓度为80％，丙酮最佳沉淀比为酶液：丙酮=1:1.4，纯化酶液做 SDS-PAGE不连续垂直平板电泳，测得两条大小为56 KD和42 KD的蛋白条带，经过酶活测定，分别为 CMCase和β-G。
　　5混合发酵的影响因素有培养基成分和培养条件，试验通过Plackett-Burman试验设计从羧甲基纤维素钠、蛋白胨、酵母粉、发酵温度和容氧量5个因子中找出影响发酵产酶的主效应因子，然后通过最陡爬坡试验中因子不同步长确定最佳组合，最后借助响应面分析Design Expert8.0软件的Box-Behnken中心组合设计试验得到主效应因子的最佳值，得到最佳产酶条件：羧甲基纤维素钠1.2g，酵母粉0.9g，最佳培养条件为32℃，180r/min摇床发酵5天得到最佳酶活368.44U/ml，而在未优化条件下混合发酵液酶活力为163.0U/mL，单菌发酵酶活为127.0U/ml，因此最优发酵条件下混合发酵酶活力是混合发酵未优化前的2.26倍，单菌发酵的2.9倍。
　　6根据GenBank中内切葡聚糖酶基因序列设计引物，通过PCR的方法，克隆获得1660bp的纤维素酶基因全长，通过构建原核表达载体，转化大肠杆菌进行诱导表达在诱导4h时目的蛋白表达量最高，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到大约56KD的纤维素酶蛋白，测定其酶活力达到526.47U/ml，是原始菌株酶活的3.57倍。