萨福克羊和哈萨克羊Toll样受体7基因SSCP多态性与绵羊肺腺瘤病的相关性分析

摘要

Toll样受体(TLR)是一类模式识别受体家族，能够启动天然免疫和获得性免疫。其中TLR7基因位于细胞内，其广泛存在于多种免疫细胞中，并且在免疫系统中发挥重要作用，与许多感染性疾病的抗性、易感性、免疫应答相关。本实验对萨福克羊和新疆哈萨克羊TLR7基因进行PCR-SSCP多态性分析，探索Toll7基因突变与绵羊肺腺瘤病易感性关系，探讨绵羊不同基因型个体在人工感染绵羊肺腺瘤病毒过程中的免疫应答反应，通过对TLR7基因多态性和OPA感染的免疫应答关系研究，为绵羊抗病育种研究提供参考依据。人工感染OPA也可以为人类的肺癌提供动物模型，更好的为研究人类肺癌提供理论依据。
　　本研究主要内容包括：⑴利用PCR-SSCP方法对萨福克羊和哈萨克羊TLR7基因进行多态性分析。结果表明TLR7基因胞外区具有多态性。萨福克羊ECD-2、ECD-5、ECD-6、ECD-7区存在多态性，哈萨克羊ECD-2和ECD-7区存在突变。经测序分析发现萨福克羊有5个点突变，其中3个错义突变，2个同义突变。而哈萨克羊只有3个突变，其中2个错义突变，1个同义突变。萨福克羊ECD-2区SSCP分析发现处于哈迪温伯格不平衡状态，且突变带型BB、AB型，哈萨克羊BB型感染内源性绵羊肺腺瘤病毒的阳性频率高于正常型，这几种基因型测序后发现其中343位和350位核苷酸发生突变，同时具有两个突变的羊感染内源性绵羊肺腺瘤病毒阳性率高于阴性的羊。推测A343G、A350G的突变可能与病毒易感性有关。⑵TLR7核苷酸A343G和A350G突变的羊与非突变羊进行人工感染绵羊肺腺瘤病毒实验，血常规检测发现攻毒后第二天，体内炎性细胞数量到达最高值， ELISA检测IFN-γ、IL-1β、TNF-α、MyD88、TLR7在血清中的表达水平，发现突变组的表达水平略高于非突变组。但差异不显著（P＞0.05）。可能是由于突变组的炎性反应中有更多的致炎因子参与对病毒的抵抗，其免疫反应更加活跃。⑶突变组和非突变组攻毒5个月后进行病理剖检观察和组织学观察，结果发现突变组羊有OPA的症状，肺脏表面有很多灰白色结节，镜检时在肺泡和支气管内可见上皮细胞肿瘤性增生灶，并散插于未腺瘤化的肺泡群中，成为乳头状腺瘤。肺泡细胞变为立方或低柱状细胞，由于肺肿瘤结节压迫临近的肺泡而导致膨胀不全或相邻肺泡融合。腺瘤病灶之间有数量不等的未腺瘤化的肺泡群，肺泡腔内充满巨噬细胞。在终末细支气管内，也有柱状上皮细胞增生并突入腔内，在其周围有淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞环绕。其中突变组比非突变组的OPA症状要严重，说明ECD-2区的突变绵羊对OPA更易感。

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前言

第一章 文献综述

一、Toll样受体

1.TLR家族成员

2 TLR7分子结构及分布

3 TLR7的配体

4 TLR7胞内的信号传导

5 TLR7的生物学功能

6 TLR7基因多态性与疾病的关系

二、单链构象多态性PCR-SSCP

1 PCR-SSCP的原理

2 PCR-SSCP 的方法

3 PCR-SSCP的优缺点

4 PCR-SSCP的研究进展

5 PCR-SSCP在动物育种方面的应用

三、绵羊肺腺瘤病

1 病原学与发病机理

2 流行病学

3 临床症状与病理变化

4 诊断与防治

5 JSRV概述

第二章 实验部分

实验一：萨福克羊和哈萨克羊Toll样受体7基因SSCP多态性分析与绵羊肺腺瘤病的关联分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验二：TLR7基因ECD-2区不同型对绵羊肺腺瘤病早期感染的免疫应答分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

实验三：TLR7基因ECD-2区突变与哈萨克羊肺腺瘤病人工感染的临床病理学观察

1材料与方法

2 结果

3 讨论

全文总结

参考文献

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