中国美利奴羊TLR4、TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析

摘要

目的：
　　该实验分别探讨了绵羊TLR4、TLR2基因的多态性且分别对其基因的多态位点进行布鲁氏菌病的易感性的相关性分析，然后进行单倍型的构建与分析，进一步得出和绵羊布鲁氏菌病有关的单倍型类型。分别将TLR4、TLR2基因的SNPs和绵羊的多种疾病进行关联研究，这能为运用辅助标记选择法筛选优良绵羊新品种，即为进行Toll样受体有关抗病机理方面的研究提供了理论基础。
　　方法：
　　1、该实验对采集的480个绵羊血清进行了虎红平板凝集实验，检测布鲁氏菌，利用生物信息学方法对NCBI上公布的绵羊的TLR4、TLR2基因外显子进行多态性比对分析，选出多态位点丰富的外显子片段进行引物的设计并扩增该基因片段，再利用PCR-SSCP的技术方法分别对TLR4、TLR2基因的单核苷酸多态位点(SNPs)进行检测，接着分别对具有不同等位基因型的绵羊个体进行克隆测序，利用分子生物学软件对测序结果进行相关性比对分析并利用 SHEsis在线软件对所有的SNP位点分别进行其等位基因频率、基因型频率的差异性统计分析，分析其与布鲁氏菌病易感性的相关性。
　　2、分别将80个布鲁氏菌阳性个体与阴性的绵羊个体TLR4的PCR产物送测序，并对测序结果进行SNPs的检测，再用软件分别对其进行Hardy-Weinberg平衡的检测及连锁不平衡的分析，最后利用SHEsis在线软件对得到的SNPs进行单倍型的构建并对其单倍型进行相关性研究，初步筛选与布鲁氏菌病易感性相关的单倍型。
　　结果：
　　1、用虎红平板凝集试验总共检测了480只绵羊的血清，其中中国美利奴羊290只，结果检测有80个布鲁氏菌感染阳性个体，210个布鲁氏菌感染阴性个体。布鲁氏菌阳性检出率为27.59％。用虎红平板凝集试验检测哈萨克羊100只，发现有16个布鲁氏菌阳性个体，84个布鲁氏菌阴性个体。布鲁氏菌阳性检出率为16%。用虎红平板凝集试验检测湖羊90只，发现有15个布鲁氏菌阳性个体，75个布鲁氏菌阴性个体。布鲁氏菌阳性检出率为16.67%。
　　2、TLR4 exon3的序列内共检测到7个SNP有1个位点为无义突变位点，其余6个为有义突变，其中不存在插入和缺失位点。TLR2基因部分序列内有8个SNP且都为无义突变位点。
　　3、对NCBI上下载的有关绵羊的所有的TLR4、TLR2的基因片段进行序列的相关性比对分析，结果表明不同绵羊品种之间的SNPs位点具有差异性。
　　4、该实验分别将 TLR4、TLR2基因的多态位点分别与布鲁氏菌病的易感性进行关联分析，可得出TLR4基因上的1180G/T位点和中国美利奴羊布鲁氏菌病的易感性具有相关性，而其他多态位点的基因频率和基因型频率在布鲁氏菌病感染阳性组与阴性组中都没有有统计学意义。而TLR2的8个位点都是无义突变因此可能和中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性不相关。
　　5、对达到构建单倍型要求的TLR4多态位点进行连锁不平衡遗传性分析，共得到2个LD Block在TLR4第三外显子内，各个SNPs之间也有一定连锁不平衡，将其按顺序称为Block1-Block2且都包含有两个SNPs位点。Block1包括C1063 T、A1085 G。Block2包括C1088T、C1094G。
　　6、对中国美利奴羊TLR4基因进行单倍型构建时共构建了7种单倍型类型，经分析发现Hap2和Hap4这两个单倍型的频率在感染阳性组中的频率分别为20.05%和32.4%，都明显比正常组高且其单倍型的频率分布具有差异有统计学意义(P<0.05)，因此可判断这两种单倍型可能和中国美利奴羊布鲁氏菌病的易感性有关。
　　结论：
　　1、对GenBank中的有关绵羊所有的TLR4、TLR2的基因片段进行序列比对分析，结果表明不同绵羊品种之间的SNPs位点具有差异性。
　　2、通过分析发现在中国美利奴羊TLR4外显子3的序列内共检测到7个SNP，有1个位点为无义突变位点，其余6个均为有义突变。 TLR2基因部分序列内有8个SNP且都为无义突变位点。推测中国美利奴羊TLR2基因的外显子区域可能相对比较保守。
　　3、对绵羊TLR4、TLR2多态性与布鲁氏菌病易感性进行相关性分析，发现TLR4基因的1180G/T位点可能与绵羊的布鲁氏菌病易感性有关联，而其他SNP位点的基因频率和基因型可能与布鲁氏菌病易感性不显著相关。
　　4、对符合要求的TLR4多态位点位点进行连锁不平衡分析总共得到2个LD Block，对所有的单倍型进行统计发现其中Hap2和Hap4这两种单倍型的频率分别在病例组中的频率都明显比正常组高且其单倍型的频率分布具有差异有统计学意义(P<0.05)，因此可判断这两种单倍型可能和中国美利奴羊布鲁氏菌病的易感性有关。

目录

声明

部分缩写的中英文对照

引言

第一章 文献综述

1.1 布鲁氏菌病

1.2 单核苷酸多态性(SNP)

1.3 单倍型(Haplotype)

1.4 Toll样受体的概述

1.5 绵羊Toll样受体家族

1.6 Toll受体基因的多态性疾病研究概况

1.7 本研究目的及意义

1.8 技术路线

第二章 中国美利奴羊TLR4、TLR2基因多态性的检测及其与布鲁氏菌病易感性相关性的分析

2.1 材料和方法

2.2 结果分析与讨论

2.3 结论

第三章中国美利奴羊TLR4基因单倍型的构建及其与布鲁氏菌病易感性关联分析

3.1 材料和方法

3.2 结果和讨论

3.3 结论

第四章 总结与展望

参考文献

致谢

作者简介

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