HBV cccDNA半定量检测方法的建立及应用

摘要

本研究分为两个部分：一、肝组织中HBVcccDNA的半定量检测方法的建立；二、HBV感染者血清及肝组织中cccDNA的检测及分析。 一、肝组织中HBVcccDNA的半定量检测方法的建立目的建立一种肝组织中共价闭合环状DNA(cccDNA)的半定量检测方法。方法收集20例肝癌患者的肿瘤组织、癌旁组织共40份肝组织，采用常规蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法提取总DNA，用Plasmid-SafeTMATP-dependentDNase消化抽提产物，使线性双链DNA、线性单链DNA和环状单链DNA被降解，所得酶切产物用特异引物进行聚合酶链反应。结果证实肝组织中存在cccDNA，且肝组织中HBVDNA用Plasmid-SafeTMATP-dependentDNase消化后的灰度值低于消化前的灰度值(0.100[阴性～1.960]和0.481[阴性～3.160]；P=0.000)；肝组织中cccDNA用Plasmid-SafeTMATP-dependentDNase消化后的灰度值低于消化前的灰度值(0.130[阴性～1.770]和0.421[阴性～2.360]；P=0.004)；分别用不同引物检测Plasmid-SafeTMATP-dependentDNase消化后的肝组织中cccDNA，所得PCR扩增产物的灰度值间呈正相关关系(r=0.844,P=0.000)。结论本方法操作简便，特异性较高，可用于半定量检测肝组织中cccDNA。 二、HBV感染者血清及肝组织中cccDNA的检测目的观察HBV感染者血清和肝组织中cccDNA的存在状况。方法根据cccDNA和松弛环状双链DNA(rcDNA)结构及理化性质的差异，应用PCR方法检测115例感染HBV的患者血清中cccDNA及其中20例肝癌患者肝组织中cccDNA，琼脂糖凝胶电泳观察cccDNA的PCR扩增产物片段，并进行灰度分析。结果115例感染HBV的患者中，血清中cccDNA与血清中HBVDNA间呈正相关关系(r=0.702,P=0.000)；血清中cccDNA在HBeAg(+)患者高于HBeAg(-)患者(0.465[阴性～2.050]和0.080[阴性～1.760]；P=0.026)；血清中cccDNA的灰度值与其ALT间呈正相关关系(r=0.347,P=0.000)。20例感染HBV的肝癌患者中，17例(85％)在癌组织中检出HBVDNA，其灰度中位数为0.231，17例(85％)在癌旁组织中检出HBVDNA，其灰度中位数为0.829，但二者比较无差别(P=0.701)；9例患者(45％)在癌组织中检出cccDNA，其灰度中位数为0.100，13例患者(65％)在癌旁组织中检出cccDNA，其灰度中位数为0.214，但二者比较无差别(P=0.213)；肝组织中cccDNA与HBVDNA正相关(r=0.778,P=0.000)。患者血清中的HBVDNA与其癌组织、癌旁组织的HBVDNA均相关(r=0.789,P=0.000；r=0.589,P=0.021)；患者血清中的cccDNA与其癌组织、癌旁组织的cccDNA均相关(r=0.566，P=0.002;r=0.465，P=0.036)；cccDNA在癌组织中的含量高于血清中的含量(0.100[阴性～1.770]和0.010[阴性～0.560]；P=0.030)，cccDNA在癌旁组织中的含量高于血清中的含量(0.214[阴性～1.390]和0.01[阴性～0.560]；P=0.001)。结论在血清中可以检测到cccDNA；肝细胞的坏死可能为血清中cccDNA的来源之一；HBV感染的肝癌患者的癌组织、癌旁组织存在HBVDNA和cccDNA；通过检测肝组织中cccDNA，可以指导临床用药，有助于决定停药的时机。

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摘要

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部份肝组织中HBV cccDNA的半定量检测方法的建立

第二部分HBV感染者血清及肝组织中cccDNA的检测

结论

参考文献

致谢