慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

摘要

慢性乙型肝炎病毒感染是世界范围内的主要公共卫生问题之一，约有四亿人受其影响。乙肝病毒基因组DNA为松弛环状DNA(relaxedcircularDNA,rcDNA)，进入肝细胞核后转换为共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)，并在整个自然病程中持续存在。目前应用的抗病毒药物，如核苷类似物、~α-干扰素等，能够有效清除外周血中的HBVDNA，但对细胞核内cccDNA的影响甚微，从而成为感染持续且难以根治的关键因素之一。 由于在乙型肝炎发病机制和抗病毒治疗中的重要地位，cccDNA检测方法的建立及其监测一直受到广泛重视，目前已经发展至将实时荧光定量PCR应用于定量检测，但是方法学上仍然存在诸多问题，细胞内其他病毒复制中间体如rcDNA的非特异性扩增是主要问题之一，此外在灵敏度、精确度、可操作性等方面仍有待提高，因此目前尚没有国家批准的试剂盒上市。 本研究旨在建立一种具有较高特异性、精确度、灵敏度和可操作性的HBVcccDNA定量检测方法，以便于基础和临床研究中广泛应用。该方法的主要内容为：取约10mg肝组织，用细胞裂解缓冲液和蛋白酶K充分消化，用液相抽提法提取核酸并用乙醇沉淀，将提取的核酸溶液分为两等份：一份用特异性降解单链DNA的核酸酶加以消化，经DNA纯化后，使用跨缺口引物进行实时荧光定量PCR分析；另一等份则用以定量检测肝细胞看家基因(β-Globin)作为内部参照，最后得出每个肝细胞中所含有的HBVcccDNA拷贝数。 实验结果：一.定性PCR检测及该方法的特异性验证我们首先用该方法对慢性HBV感染者肝组织中HBVcccDNA进行了定性PCR检测，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析证实与目的片段大小一致；割取琼脂糖凝胶上的扩增产物，经纯化后进行DNA测序分析，测序结果显示与目的片段的序列基本一致，且产物片段包含了rcDNA的缺口(nick)部分；缪晓辉等学者研究发现高水平的rcDNA常导致有些HBVcccDNA检测方法出现假阳性，我们选择了35例外周血HBVDNA＞105拷贝/毫升患者的血清，用该方法进行PCR扩增后结果均未呈现阳性。通过上述三种途径，有效地证实了该方法的特异性。 二.肝组织中HBVcccDNA的定量检测在上述方法的基础上用SYBRGreenⅠ和Taqman探针两种方法对肝组织中的HBVcccDNA进行荧光定量PCR检测，定量所需标准品为自行提取并定量的包含HBV基因组全序列的质粒pBSHBV3.6Ⅱ，同时应用试剂盒检测看家基因(β-Globin)的数量作为内部参照。结果显示：将跨缺口引物、核酸酶消化等措施与SYBRGreenⅠ荧光染料结合所建立起来的HBVcccDNA定量检测方法具有较高的特异性、敏感性、稳定性和可操作性，结合看家基因的检测提高了检测结果的可比性。但是应用Taqman探针技术未能建立起令人满意的检测方法。

目录

第一部分慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定性PCR检测及其特异性分析

第二部分慢性HBV感染者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

小结

致谢

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