基因重组hVEGF165腺相关病毒的构建及其在间充质干细胞和心肌细胞中的表达

摘要

本实验利用AAV包装平台——rAAV-Helperfreesystem，构建携带人VEGF165基因的重组AAV和携带EGFP报告基因的重组AAV载体，并初步研究携带人VEGF165基因的AAV载体在对间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)和心肌的表达情况，为下一步在体治疗大鼠心力衰竭的动物实验奠定基础。 第一部分基因重组hVEGF165腺相关病毒载体和基因重组增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的包装目的：应用基因工程和分子生物学技术构建包装病毒用载体质粒，并以三质粒共转染方法包装hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)腺相关病毒。 方法：1.质粒pcDNA3-hVEGF165质粒用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切获得576bp的hVEGF165cDNA全长片断，电泳胶回收备用。pCMV-MCS质粒用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切，胶回收开环质粒DNA。hVEGF165cDNA片断和开环pCMV-MCS定向连接，构建过渡质粒pCMV-hVEGF165。所构建质粒电穿孔转化E.coliDH5α感受态细菌，挑取菌落克隆扩增培养提取质粒后酶切、PCR和测序等方法鉴定。测序引物上下游分别位于pCMV-hVEGF165质粒的beta-globinintron和hGHpA中，扩增片断长度876bp，电泳结果和测序结果准确无误后，进行下一步实验。 2.为了避免克隆过程中ITR的丢失引起病毒包装效率下降，以NOtⅠ酶切质粒pCMV-hVEGF165和AAV载体质粒pAAV-MCS，行电泳、胶回收含pAAVITR的片断和pCMV-hVEGF165真核表达框，两者连接构建质粒pAAV-hVEGF165。所构建质粒电穿孔转化E.coliDH5α感受态细菌，挑取菌落克隆扩增培养提取质粒后用双酶切、PCR和测序等方法鉴定。PCR鉴定引物上下游分别位于pAAV-hVEGF165上下游L-ITR和R-ITR中，共扩增2976bp片断；以NotⅠ和PstⅠ双酶切pAAV-hVEGF165质粒，可以切出约140bp大小的ITR片断；测序引物同pCMV-hVEGF165测序引物。 3.包装病毒用质粒pAAV-EGFP构建流程同pAAV-hVEGF165。首先根据EGFP上下游序列设计引物，上游引物：5’-AGAGTCGACAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’引入SalⅠ酶切位点；下游引物：5’-GAGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’引入BglⅡ酶切位点。以质粒pEGFP-N1为模板，进行PCR，扩增出720bp两端分别带有SalⅠ酶切位点和BglⅡ酶切位点的EGFP片段，SalⅠ和BglⅡ双酶切PCR产物胶回收后定向连接入用SalⅠ和BglⅡ双酶切的pCMV-MCS开环质粒DNA中，获得pCMV-EGFP质粒，电穿孔转化E.coliDH5α感受态细菌，挑取菌落克隆扩增培养提取质粒后行双酶切、PCR和测序等方法鉴定。以NotⅠ酶切质粒pCMV-EGFP和AAV载体质粒pAAV-MCS，行电泳后胶回收含pAAVITR的片断和pCMV-EGFP真核表达框，两者进行连接，构建质粒pAAV-EGFP。所构建质粒电穿孔转化E.coliDH5α感受态细菌，挑取菌落克隆扩增培养，提取质粒后PCR产物电泳、酶切和测序鉴定 4.培养HEK293细胞，待HEK293细胞长至80-90％融和，取pAAV-hVEGF165(或pAAV-EGFP)、pRC和pHelper电转化共转染HEK293细胞，包装rAAV-hVEGF165或rAAV-EGFP，取电转化培养72小时后的HEK293细胞进行氯仿处理——NaCl沉淀—氯仿抽提3个步骤，分离浓缩和纯化rAAV，纯化后rAAV通过AVSachTMELISA法测定rAAV颗粒滴度，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳考马斯亮蓝染色观察检测rAAV的衣壳蛋白，将纯化后的rAAV病毒样本磷戊酸负染电镜下观察。 结果：本实验利用基因工程和分子生物学技术构建pCMV-hVEGF165和pCMV-EGFP过渡质粒，然后再克隆入AAV载体质粒构建pAAV-hVEGF165和pAAV-EGFP，目的是为了防止pAAV质粒中的ITR在操作过程中的丢失而影响病毒包装效率。所有质粒PCR产物电泳结果、酶切结果和测序结果正确无误，并保证了pAAV-hVEGF165和pAAV-EGFP质粒中ITR的存在。应用电穿孔方法三个质粒共转染HEK293细胞，分离纯化后获得高滴度和纯度的rAAV-hVEGF165和rAAV-EGFP。包装纯化后获得病毒滴度可达到2×1011，SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色可见3条特征性AAV衣壳蛋白条带，电镜观察病毒颗粒均匀，病毒大小20～25nm，呈多面体形态。重组AAV载体包装成功，为后继体外细胞实验研究奠定了基础。 第二部分大鼠间充质干细胞和乳鼠心肌细胞的培养和鉴定目的：建立大鼠MSCs和心肌细胞的培养和纯化条件。 方法：1.MSCs的分离、培养和扩增：无菌条件下将4只4-6周雄性Wistar大鼠(120-150克)股骨骨髓腔冲洗液用培养液洗涤2次后，小心吹打成单细胞悬液，以4×105/cm2接种细胞于培养瓶，同时加入100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素，于37℃，5％CO2恒温培养箱培养。用倒置显微镜逐日进行观察。接种72小时后换液，去除悬浮的造血干细胞及血细胞，换新鲜培养基继续培养，以后每三天换液一次。 2.乳鼠心肌细胞的分离和培养：取15只出生后1-3天的Wistar大鼠，断颈处死，在装有75％酒精的烧杯中浸泡5分钟消毒，在超净工作台中，无菌条件下取出大鼠心脏，放在装有无菌1×PBS的无菌培养皿中，用在无菌1×PBS反复冲洗后，用眼科剪小心将心脏剪成≤1mm3的碎块，用0.125％的胰蛋白酶消化液进行消化，去掉首次消化的上清，收集后面消化的上清，直至心脏碎块呈现白色纤维状，用10％FBS的RPMI1640培养液洗涤细胞2次，用吸管将细胞培养液吹打均匀，加入终浓度为100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素后，移入细胞培养瓶中。放入37℃，5％CO2恒温培养箱培养90分钟后(差速贴壁)，吸取培养瓶中的培养液，以3×105细胞/ml接种于新的培养瓶中，同时加入Brdu至0.1mmol/L，12小时后更换培养液。以后，每隔3天换液一次。培养3-4天后，细胞达到融合状态进行实验。 3.应用H-E染色和免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定。结果：1.培养出大鼠MSCs，对第3代细胞进行鉴定，95％以上为大鼠MSCs。 2.培养出乳鼠心肌细胞，95％为乳鼠心肌细胞。为下一步实验奠定了细胞基础。 第三部分基因重组野生型hVEGF165腺相关病毒载体在间充质干细胞和心肌细胞表达的实验研究 目的：利用携带hVEGF165的基因重组AAV转染MSCs和心肌细胞进行体外实验研究，观察其在这两种细胞的表达情况。 方法：1.体外培养大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞方法同前。 2.以不同剂量rAAV-EGFP(1×104、1×105、1×106、1×107、2×106v.p./cell)转染大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞96小时后用倒置荧光显微镜观察细胞表达绿色荧光蛋白情况。 3.rAAV-hVEGF165以1×107v.p./cell转染MSCs，以1×106v.p./cell转染乳鼠心肌细胞，用双抗体夹心ELISA法测定第4、7、10天的培养上清中的VEGF浓度。 结果：1.rAAV-EGFP转染大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞后96小时荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光，以不同剂量(1×104、1×105、1×106、1×107、2×106)V.p./cell感染细胞后可见荧光细胞数比例MSCs为3％，29％，38％，53％，57％；乳鼠心肌为7％，33％，55％，57％，59％。rAAV-EGFP在大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞中可以表达携带的外源基因EGFP。 3.以1×107v.p./cell转染大鼠MSCs和以1×106v.p./cell转染乳鼠心肌细胞后，分别在第4、7、10天检测培养上清液中的VEGF浓度，均呈逐渐升高趋势，并且显著高于空病毒对照组和未感染组，表明构建的重组AAV可以有效的转染两种细胞，并且稳定表达。 结论：成功构建hVEGF165腺相关病毒和增强型绿色荧光蛋白腺相关病毒，转染大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞体外实验表明，重组AAV在两种细胞内可以持续稳定的表达VEGF蛋白，为下一步体外实验治疗大鼠心力衰竭的实验奠定基础。

目录

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摘要

英文缩略语

病毒构建及实验流程图

第一部分基因重组hVEGF165腺相关病毒载体和基因重组EGFP腺相关病毒载体的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分大鼠间充质干细胞和乳鼠心肌细胞的培养和鉴定

第三部分基因重组hVEGF165腺相关病毒载体在间充质干细胞和心肌细胞表达的实验研究

结论

参考文献

骨髓间质干细胞及其在缺血性心脏病中研究

在学期间发表论文和参编著作

致谢