野生型与突变型MYOC基因质粒的构建及真核表达的研究

摘要

目的：1.克隆人MYOC基因，构建野生型MYOC基因真核表达质粒pEGFP-N3-wMYOC。2.选择一个错意突变Pro370Leu(MYOC基因一个杂合性C1109T突变，使第370个氨基酸由原来的脯氨酸变为亮氨酸)，构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1-mMYOC。3.比较Pro370Leu突变型MYOC(mMYOC)与野生型MYOC(wMYOC)基因在真核细胞中表达的差别，进一步了解原发性开角型青光眼(primaryopenangleglaucoma，POAG)的发病机制。 方法：1.用RT-PCR法，从人眼组织(角膜缘睫状体)中扩增MYOCcDNA，克隆入载体pGEM-T，然后酶切，定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N3中，构建pEGFP-N3-MYOC重组表达质粒，然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定。2.以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因(mMYOC)，并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上，得到pDsRed2-N1-mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定。3.将携带有wMYOC基因的绿色荧光蛋白重组表达载体pEGFP-N3-wMYOC和携带有mMYOC基因的红色荧光蛋白重组表达载体pDsRed2-N1-mMYOC，分别及共同转染真核细胞Hela，用荧光显微镜观察蛋白表达定位情况，并用Western印迹分析蛋白分泌情况和用流式细胞仪观察凋亡。 结果：1.经测序鉴定MYOCcDNA序列正确，并经酶切和DNA测序证实pEGFP-N3-wMYOC重组质粒构建正确。2.经酶切和DNA测序，证实pDsRed2-N1-mMYOC重组质粒构建成功。3.荧光显微镜观察到wMYOC蛋白和mMYOC蛋白均成功表达，都定位在细胞质中，但wMYOC蛋白分布均匀，而mMYOC蛋白呈聚集状态。共表达时，wMYOC蛋白也呈聚集状态，且与mMYOC蛋白有共定位倾向。经Western印迹分析，相应的转染细胞可分泌wMYOC蛋白，而不能分泌mMYOC蛋白；当共表达时，也没有wMYOC蛋白分泌。流式细胞仪观察到mMYOC蛋白能促进凋亡，共表达时也促进凋亡。 结论：1.成功克隆POAG相关基因MYOCcDNA，2.成功构建野生型MYOC基因真核表达质粒pERFP-N3-wMYOC和Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1-mMYOC。3.野生型和Pro370Leu突变型MYOC基因都能成功表达，都定位在细胞质；mMYOC蛋白表现为聚集倾向和分泌障碍及促进凋亡作用，并且影响wMYOC蛋白的表达和分泌特性。

目录

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摘要

缩略词表

前言

第一部分MYOC基因cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

第二部分Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒的构建

第三部分野生型与Pro370Leu突变型MYOC基因真核细胞表达的研究

讨论

结论

参考文献

致谢

附录一综述一 开角型青光眼相关基因的研究

附录二综述二 青光眼突变基因遗传筛查技术的进展

附录三 在学期间发表的文章