反义肽核酸阻断促甲状腺激素受体的表达以及对Graves'病可能的治疗作用

摘要

目的：1.探讨反义肽核酸对FRTL细胞膜表面促甲状腺激素受体表达的影响2.探讨反义肽核酸对类Graves'病可能的治疗作用 方法：1.细胞部分1.1设计两种分别与TSHRmRNA不同片段互补的asPNA，命名为NLS-asPNA1，NLS-asPNA2，并合成另外两种asPNA,即将上述两种PNA连接上荧光素(Fluorescence，FL)，称为NLS-asPNA1-FL，NLS-asPNA2-FL，另外合成一段非相关的对照asPNA序列称为NLS-scrPNA和NLS-scrPNA-FL。 1.2用荧光显微镜观察NLS-asPNA能否进入到细胞中去。将细胞分为A、B、C、D四组，其中B、C、D三组分别在培养基内加入10μM的NLS-asPNA1-FL，NLS-asPNA2-FL和NLS-scrPNA-FL，A组不加PNA，一起培养48h后取出细胞，涂片后置于荧光显微镜下观察。 1.3用MTT法检测asPNA对细胞是否有毒性作用，分组同上，将NLS-asPNA1，NLS-asPNA2和NLS-scrPNA分别加入B、C、D三组的培养基内，A组不加PNA，各组分别于24h，48h,72h后测定OD值，结果以T/C表示。(T代表B、C、D三组在各个时间点的OD值，C代表A组在各个时间点的OD值) 1.4用RealtimeRT-PCR检测NLS-asPNA对TSHRmRNA表达的影响，分A、B、C三组，培养基内分别加NLS-asPNA1，NLS-asPNA2，NLS-scrPNA，终浓度为10μM，各组分别于0h，12h，24h，48h时分别将细胞取出，提取细胞总RNA，逆转为cDNA，用RealtimeRT-PCR试剂盒测定样品mRNA水平。 2.动物部分2.1豚鼠脂肪细胞膜提取TSHR，称为gTSHR，通过CBG蛋白定量法测定其浓度。 2.2合成TSHRaa36-42，用戊二醛法偶联TSHRaa36-42和KLH，称为KLH-TSHR36-42。 2.3动物分组：A组：gTSHR+KLH-TSHR36-42；NLS-asPNA1治疗组B组：gTSHR+KLH-TSHR36-42；NLS-scrPNA治疗组C组：gTSHR+KLH-TSHR36-42；生理盐水治疗对照组D组：生理盐水对照组gTSHR，KLH-TSHR36-42和NS均用弗氏完全佐剂乳化后注入小鼠腹腔内，每2周免疫一次，共免疫3次。然后A、B两组用NLS-asPNA1和NLS-scrPNA进行腹腔注射治疗，于第十周处死小鼠，取双侧甲状腺，一侧用于病理学检测，另一侧用于检测TSHRmRNA的表达。每次免疫前2天取血。 2.4测定血清各项指标2.4.1ELISA法测定血清TRAb水平，结果用指数表示2.4.2RIA测定血清TT4水平2.4.3FRTL细胞株测定待测血清IgG与细胞反应后培养液中cAMP含量，根据待测样品cAMP含量，计算TSAb指数。 2.5Real-timeRT-PCR检测BALB/c小鼠甲状腺TSHRmRNA的水平2.6病理图片观察小鼠甲状腺的病理变化 结果：1.细胞部分1.1细胞涂片后经荧光显微镜观察发现，B、C、D三组的PNA均可以进入到细胞中去。 1.2在24h，48h，72h后分别测定T/C值，结果显示，各组在不同的时间之间并没有显著性差异。 1.3RealtimeRT-PCR结果显示，NLS-asPNA1对TSHRmRNA的表达量的影响为，在12h时与0h相比，没有显著性变化，24h时，为oh的43％，到48h时，仅为0h的16.98％，呈现出时间依赖性。NLS-asPNA2对TSHRmRNA的表达量的影响为：在12h时，为0h的81.28％，24h时为0h的61.66％，而48h后为0h的33.11％，也呈时间依赖性。随着NLS-scrPNA与细胞培养时间的延长，TSHRmRNA的表达量没有显著性的变化。 2.动物部分2.1通过CBG法蛋白定量可以测出，豚鼠脂肪细胞膜提取TSHR的浓度为59mg/dL。 2.2血清各项指标2.2.1血清TRAb水平：A、B、C三组小鼠在第6周均升高，与各自的0周相比有显著性差异，在第10周时仍有所升高，与0周相比，有显著性差异，D组在第6周和第10周有所升高但均没有显著性变化。 2.2.2血清TSAb水平：A组6周后TSAb水平比0周有所下降，存在显著性差异，第10周时，TSAb水平仍比0周下降，有显著性差异。B组6周后TSAb水平比0周有所升高，在经NLS-scrPNA注射4周后，TSAb水平仍增高，但却没有显著性差异。C组小鼠在第6周和第10周TSAb水平略有升高，但与0周相比也没有显著性差异，D组TSAb水平变化不明显。 2.2.3血清T4水平：A组在第6周时，血清TT4水平比0周增高，有显著性差异，在经NLS-asPNA1注射4周后，TT4水平比第6周降低，有显著性差异。B组6周后TT4水平比0周有所升高，存在显著性差异，第10周TT4水平略有下降，但没有显著性差异。而C组TT4水平变化同B组，D组TT4水平变化不明显，没有显著性差异。 2.3RealtimeRT-PCR检测结果：A组甲状腺TSHRmRNA水平低于C组，二者之间有显著性差异；而B组与C组之间却没有显著性差异(P＞0.05)。 2.4病理检测结果：B、C两组小鼠甲状腺滤泡增大，滤泡上皮增生，胶质增多及浓缩，并且有较多的新生滤泡。而A组小鼠甲状腺滤泡上皮无明显增生，无胶质浓缩。 结论： NLS-asPNA可以进入到FRTL细胞中，下调FRTL细胞TSHR的表达，并呈时间依赖性，可以缓解甲状腺组织的病理损伤，从而对GD的治疗有指导作用。

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实验结果

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结论

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