针对BAK的siRNA抑制由胶质瘤细胞诱导的树突状细胞凋亡及其机制

摘要

目的:树突状细胞与胶质瘤共培养，观察胶质瘤细胞诱导树突状细胞凋亡；观察针对BAK的siRNA对树突状细胞凋亡的影响，检测相应的凋亡基因，探讨其可能凋亡通路，为胶质瘤的免疫治疗提供理论依据。 方法:树突状细胞与胶质瘤细胞通过孔径0.4μm Trans—well共培养，设置空白DC2.4，为对照组，采用MTT法观察其活性，细胞存活率=实验组吸光度/对照组吸光度×100％。采用脂质体的方法转染表达针对BAK的siRNA序列的质粒(A：229序、B：310序、C：579序、D：NC序)进入树突状细胞，并利用G418筛选出稳定表达株，通过western blot和PCR的方法鉴定出稳定表达有效干扰序列的树突状细胞；稳定表达有效干扰序列的树突状细胞和胶质瘤细胞共培养(b组)，设置a组空白DC2.4、c组胶质瘤细胞和DC2.4共培养两个对照组，24h后观察树突状细胞凋亡的改变。通过western blot测定相关基因BAK的表达，观察caspase8，caspase3及胞浆中的细胞色素C的变化，进而推断出凋亡的可能通路。 结果:胶质瘤细胞与树突状细胞共培养后，与空白树突状细胞组相比树突状细胞的活性降低了，吸光值与空白树突状细胞组相比为0.514±0.031；含有siRNA质粒转染入树突状细胞后，各组BAK的表达均降低，以PGPU6/GFP/Neo—BAK-310组为明显。western blot和RT-PCR检测出310序列BAK的表达降低(western blot：A：0.83、B：0.14、C：0.75、D：0.89、未转染：0.92；RT-PCR：A：0.42、B：0.08、C：0.39、D：0.46、未转染：0.49P<0.05)。稳定表达有效干扰序列的树突状细胞和胶质瘤细胞共培养后，与c组相比树突状细胞的活性较高，树突状细胞的caspase8表达量无明显差异(a：0.78 b：0.75 c：0.77，P>0.05)，caspase3及胞浆中的Cytc减少(caspase3：a：0.67 b：0.70 c：0.2；Cytc：a：0.70 b：0.71 c：0.17 P<0.05)。 结论:胶质瘤细胞与树突状细胞共培养以后，可以诱导树突状细胞凋亡，凋亡途径可能是线粒体途径；关于BAK的有效siRNA序列可抑制胶质瘤细胞诱导的树突状细胞的凋亡，为延长树突状细胞的寿命，提高它的抗原呈递能力提供了理论依据。

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