蛋白酶体抑制剂硼替佐米通过内质网应激调亡途径CHOP诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的机制研究

摘要

第一部分 内质网应激指标在不同浓度的硼替佐米诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44损伤中的作用
　　 目的:传代培养苏州大学人脑胶质瘤细胞株SHG-44,通过给予不同浓度的硼替佐米进行干预,观察内质网应激指标在不同浓度硼替佐米处理后的变化情况。
　　 方法:通过传代方法培养人脑胶质瘤细胞。选取硼替佐米处理24小时,采用处理前(对照组)和不同浓度(1、2、5、10nmol／L)处理后的胶质瘤细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。采用流式细胞仪观察胶质瘤细胞的凋亡,MTT检测细胞活力变化。用RT-PCR和western-blot测定内质网应激指标GRP78,CHOP。
　　 结果:MTT比色法检测发现,硼替佐米处理24h后,SHG-44细胞活力明显下降56.2％(P<0.05),且随着硼替佐米浓度的加大,继续呈现显著下降的趋势(P<0.05)。5nmol／L组、10nmol／L组细胞活力下降较为明显(P<0.05),5nmol／L组、10nmol／L组之间无统计学差异(P>0.05)。流式细胞仪检测结果发现,与对照组比较,硼替佐米作用24h后,各组细胞凋亡率显著升高(P<0.05),5nmol／L组、10nmol／L组细胞凋亡率较为明显(P<0.05),5nmol／L组、10nmol／L组之间无统计学差异(P>0.05)。RT-PCR结果显示,与对照组比较,硼替佐米作用24h后,SHG-44细胞ERS相关基因GRP78、CHOP表达显著增加,且随着硼替佐米浓度的加大,继续呈现增加的趋势。Western-blot结果与RT-PCR结果相一致。
　　 结论:在硼替佐米诱导胶质瘤细胞凋亡的过程中,ERS是发挥作用的主要通路之一,5nmol／L是硼替佐米最佳作用浓度。
　　 第二部分 硼替佐米通过内质网应激凋亡途径CHOP信号转导通路对SHG-44细胞凋亡的相关机制分析
　　 目的:探讨内质网应激指标在硼替佐米诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44损伤中的作用。同时选择CHOP信号转导途径,使用CHOP的特异性抑制剂多柔比星观察硼替佐米的作用变化,进一步分析硼替佐米在诱导胶质瘤细胞内质网应激凋亡中的信号转导机制及作用。
　　 方法:通过传代方法培养人脑胶质瘤细胞。实验分为5组:正常对照组、DTT组、硼替佐米组、多柔比星组、硼替佐米+多柔比星组。实验终止后,采用流式细胞仪观察胶质瘤细胞的凋亡,MTT检测细胞活力变化。用RT-PCR和western-blot测定内质网应激指标GRP78,CHPOP。
　　 结果:MTT比色法检测发现,5nmol／L达到了最佳的抑制浓度,SHG-44细胞活力明显下降56.2％(P<0.05),实验分组后,与对照组比较,硼替佐米作用24h后,细胞凋亡率显著增加(54.35±3.15％vs 3.2±0.42％,p<0.05),GRP78mRNA、CHOP mRNA表达明显增加(p<0.05)；但给予DTT后,凋亡率及GRP78mRNA、CHOP mRNA表达有所升高(P<0.05),硼替佐米+多柔比星较DTT有所减低,但不如单独使用多柔比星组降低明显(p<0.05)。Western—blot结果显示,与对照组比较,硼替佐米作用后可以引起ERS,硼替佐米作用24h后细胞内质网应激指标GRP78,CHOP表达明显增加(p<0.05),DTT组细胞GRP78,CHOP表达明显增加(p<0.05),硼替佐米+多柔比星组GRP78,CHOP表达有所减低,但不如单独给予多柔比星组降低明显(p<0.05)。
　　 结论:1.蛋白酶体抑制剂硼替佐米可诱导人脑胶质瘤细胞SHG-44细胞凋亡;
　　 2.在硼替佐米处理诱导胶质瘤细胞凋亡的过程中,ERS是发挥作用的主要通路之一;
　　 3.CHOP通道抑制剂多柔比星可以部分阻断内质网应激,提示CHOP信号通道为硼替佐米发挥凋亡作用的途径之一。