骨髓增生异常综合征恶性造血克隆的早期识别及根治研究

摘要

目的：
　　 从免疫表型、分子生物学、细胞形态学、组织化学等方面寻找与骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic Syndrome，MDS）恶性克隆负荷显著相关的辅助诊断指标，并在体外及体内对不同方案治疗MDS的机制及疗效进行研究。
　　 方法：
　　 研究对象为MDS患者73例及正常对照12名。第一部分采用流式细胞术（FCM）检测白介素-3受体a（CD123）和粒细胞集落刺激因子（GranulocyteColonv Stimulating Factor，G-CSF）受体（CD114）在MDS患者骨髓中的表达情况，从免疫表型方面寻找MDS恶性克隆的分子标志。第二部分采用半定量RT-PCR的方法检测dlkl（delta-like1）基因在MDS患者骨髓中的表达情况，并分析其临床意义，从分子生物学角度探寻恶性克隆的分子标志。第三部分利用t检验、X2检验、Logistic回归分析等统计方法分析MDS患者骨髓形态学、外周血象、铁代谢等指标与典型染色体异常、恶性克隆负荷及分子遗传学进展的相关性，从细胞形态学和组织化学等方面探索MDS恶性克隆的标志。第四部分体外培养MDS患者骨髓粒.巨噬细胞集落形成单位（GM-CFU），14天后分别加入地西他滨、HA（高三尖衫酯碱+阿糖胞苷）、DA（柔红霉素+阿糖胞苷）等药物，采用FCM检测72h后细胞的凋亡率及分化抗原CD11b、HLA-DR的表达，并采用RT-PCR检测凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）mRNA的表达，研究不同药物对MDS患者GM-CFU的作用及机制。第五部分将MDS患者根据国际预后积分系统（IPSS）评分分为中低危组和高危组，对依据不同危险度实施的分层治疗疗效进行分析。
　　 结果：
　　 第一部分、MDS患者骨髓CD34+细胞分化异常，CD34+CD38-/CD34+比例（（14.034±5.27）％）显著高于对照组（（7.704±4.36）％）（P<0.01）；MDS患者骨髓CD123+CD34+CD38-/CD34+CD38-表达率为（48.39±28.15）％，显著高于对照组（（8.754±11.71）％）（P<0.01），全血细胞减少患者的CD123表达率（（63.15±23.84）％）显著高于一系（（19.30±8.65）％）及两系（（32.32±22.93）％）血细胞减少者（P均<0.01），染色体异常患者的CD123表达率（（54.294±24.72）％）显著高于染色体正常组（（35.404±29.07）％）（P<0.05），CD123+CD34+CD38-/CD34+CD38-表达率与骨髓原始细胞比例（r=0.457，P<0.05）及恶性克隆负荷呈显著正相关（r=0.357，P<0.05）； CD123+CD34+CD38-细胞的CD114表达率为（34.82±29.58）％，显著低于CD123+CD34+CD38-细胞中的CD114表达率（（53.48+27.41）％）（P<0.05），表型为CD123+CD34+CD38-的细胞可能是MDS的恶性克隆细胞。
　　 第二部分 dlk1基因在MDS患者骨髓单个核细胞（BMMNC）中的表达量为0.7342±0.3652，显著高于对照组（0.4801±0.1759）（P<0.05）；随MDS亚型进展，dlk1基因表达量显著增高（P<0.05）；dlk1基因表达量与骨髓原始细胞比例呈显著正相关（r=0.467，P<0.05）；染色体异常组的dlk1表达量（0.9007±0.4334）显著高于染色体正常组（0.6411±0.2630）（P<0.05）；dlk1表达量较高（≥0.8）组的平均恶性克隆负荷（0.4134±0.3999）显著高于dlk1表达量较低（<0.8）组（0.1517±0.3109）（P<0.05）。
　　 第三部分、MDS患者常见的染色体核型异常由多至少依次为-7、+8、+21/-21、-5/5q-、-Y等。特征性病态造血与典型染色体异常的相关性包括：双核粒细胞、红细胞缗钱状与-7显著相关；双核粒细胞与-5/5q-显著相关；粒细胞分叶不良与-20/20q-显著相关（P均<0.05）。MDS高恶性克隆负荷的指征包括：A组（骨髓涂片见到奇数核红细胞、外周血出现幼稚细胞）、B组（骨髓涂片见到双核粒细胞、粒细胞分叶不良、骨髓三系病态造血、PAS阳性、血清铁蛋白≥220ng/mL、不饱和铁结合力（UIBC）<40umol/L）。满足A组两个条件，或满足A组其一同时满足B组两个及以上条件，或满足B组4个及以上条件者具有显著较高的恶性克隆负荷（P<0.01）。MDS患者分子遗传学进展的危险因素包括：骨髓涂片可见奇数核红细胞、粒细胞巨幼样变及高髓系分化指数（Differentiation Index，DI）（P<0.05）。
　　 第四部分、地西他滨可诱导MDS细胞凋亡，经1.6mmol/L、3.2mmol/L、6.4mmol/L地西他滨作用后，细胞凋亡率为别为（21.969±10.187）％、（24.2464±9.053）％、（26.438±10.742）％，显著高于对照组（13.965±3.503）％（P均<0.05），呈浓度依赖性；地西他滨同时可促进细胞分化，经3.2mmol/L、6.4mmol/L地西他滨作用后，细胞表面分化抗原CD11b表达率分别为（43.546±11.222）％、（46.8544±10.347）％，均显著高于对照组（（31.1964±12.839）％）（P均<0.05）。经HA作用后，细胞凋亡率为（32.048±9.525）％，显著高于对照组（（13.965±3.503）％）（P<0.05），死亡率（（31.550±9.514）％）亦显著高于对照组（（7.399±5.990）％）（P<0.05）。经DA作用后，细胞死亡率（（55.396±16.063）％）显著高于其他各组（P<0.05），凋亡率（（4.664±4.074）％）、CD11b表达率（（14.422±14.921）％）均显著低于其他各组（P均<0.05）。
　　 第五部分、根据不同危险度实施分层治疗是MDS治疗的主导思想；中低危组患者应用造血刺激因子（Htematopoietic Stimulating Factor，HSF）治疗的总有效率（74.4％）及总显效率（65.1％）均显著高于不用HSF组（有效率36.4％、显效率18.2％）（P均<0.05），贫血患者应用促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）治疗的血红蛋白显效率（28.6％）显著高于不用EPO组（0％）（P<0.05），粒细胞减少患者应用G-CSF治疗的中性粒细胞有效率（69.0％）显著高于不用G-CSF组（20.0％）（P<0.05）；IPSS高危组MDS及MDS转白患者首选IA（去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷）方案化疗，地西他滨治疗MDS的疗效初步观察较好，仍有待于大样本量的长期观察。
　　 结论：
　　 （1）MDS患者高恶性克隆负荷的指征包括：CD123高表达、dlk1基因高表达、骨髓涂片可见奇数核红细胞、外周血可见幼稚细胞；
　　 （2）MDS患者特征性病态造血与典型染色体异常的相关性包括：双核粒细胞和红细胞缗钱状与-7显著相关、双核粒细胞与-5/5q-显著相关、粒细胞分叶不良与-20/20q-显著相关：
　　 （3）MDS患者分子遗传学进展的危险因素包括：骨髓涂片可见奇数核红细胞、粒细胞巨幼样变及高髓系分化指数；
　　 （4）根据不同危险度实施分层治疗是MDS治疗的主导思想；IPSS中低危组MDS患者可获益于造血刺激因子的应用，IPSS高危组MDS及MDS转白者首选IA方案化疗，地西他滨在体外及体内对MDS均有较好的疗效。