生育三烯酚通过Wnt信号途径诱导结肠癌细胞死亡的机制研究

摘要

目的：
　　 本研究旨在通过体外培养人结肠癌SW620细胞，利用分子生物学实验技术，以Wnt信号途径为中心，探讨生育三烯酚诱导结肠癌细胞发生死亡的分子机制。
　　 方法：
　　 1.生育三烯酚对SW620细胞增殖的影响
　　 体外培养SW620细胞，分别加入不同浓度生育三烯酚(δ-生育三烯酚终浓度分别为0、1、2.5、5、10、15、20、25、30和40μmol/L；γ-生育三烯酚终浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90和100μmol/L)和乙醇(溶剂对照)作用24 h后，以MTT实验分别观察γ-、δ-生育三烯酚对SW620细胞存活率的影响。
　　 分别以浓度为5、10、15、20μmol/L的δ-生育三烯酚及15、30、45、60μmol/L的γ-生育三烯酚和乙醇(溶剂对照)作用于细胞，利用荧光染色(AO/EB染色，DAPI染色)、电镜超微结构观察、流式细胞术、Caspase-3活性测定等方法检测细胞的死亡情况，并比较加入z.VAD.fmk与否时细胞的存活率。
　　 2.生育三烯酚抑制SW620细胞增殖的机制研究
　　 体外培养SW620细胞，分别以浓度为5、10、15、20μmol/L的δ-生育三烯酚及15、30、45、60μmol/L的γ-生育三烯酚和乙醇(溶剂对照)作用于细胞。24h后，提取细胞内总RNA进行Real-time RT-PCR检测wnt-1、β-catenin、cyclinD1、c-jun、MMP-7的mRNA表达。同时，提取总蛋白进行Western blot检测上述蛋白的表达情况。
　　 结果：
　　 1.γ-、δ-生育三烯酚分别作用24 h后，与乙醇对照组相比，各剂量组γ-、δ-生育三烯酚均可以使SW620细胞存活率降低(P<0.05)，且细胞存活率分别随着γ-、δ-生育三烯酚剂量的增加呈现降低的趋势。γ-、δ-生育三烯酚对SW620细胞的IC50值分别为31.35μmol/L，15.18μmol/L。
　　 2.通过细胞形态学观察发现，γ-、δ-生育三烯酚分别作用SW620细胞6和24 h后，细胞内未见细胞核不规整，膜泡化，核染色体DNA浓缩、着边呈新月状，凋亡小体形成等典型的凋亡现象，取而代之的是细胞内出现大量空泡。电镜结果显示线粒体发生了肿胀及空泡变。
　　 3.Caspase抑制剂z.VAD.fmk加入后，SW620细胞生存率仍随着δ-生育三烯酚的剂量增加而呈现下降的趋势(P<0.05)，相同剂量组间细胞生存率的差异不具有统计学意义(P>0.05)；δ-生育三烯酚分别作用SW620细胞6和24 h后，处理组细胞凋亡率与对照组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)；δ-生育三烯酚作用SW620细胞24 h后，随作用剂量的增加，Caspase-3活性并未增强(P>0.05)。γ-生育三烯酚的结果与δ-生育三烯酚的结果相类似。
　　 4.在不同剂量的δ-生育三烯酚作用24h后，SW620细胞内wnt-1、β-caternin的mRNA和蛋白的表达量下降；对Wnt信号途径下游癌基因cyclin D1、MMP-7的mRNA表达无影响，但是能够降低cyclin D1、MMP-7蛋白量的水平。
　　 5.在不同剂量的γ-生育三烯酚作用24h后，SW620细胞内β-catenin、c-jun、cyclinD1的mRNA和蛋白表达量有不同程度的下降；对wnt-1、MMP-7的mRNA表达无影响，但可使其蛋白表达量有不同程度的下降。
　　 结论：
　　 1.证实生育三烯酚抑制SW620细胞增殖。同时，发现δ-生育三烯酚对SW620细胞的抑制作用强于γ-生育三烯酚。
　　 2.生育三烯酚可以诱导SW620细胞产生paraptosis样死亡。
　　 3.生育三烯酚对Wnt信号途径的影响可能是其诱导SW620细胞paraptosis样死亡的机制之一。