生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式及机制研究

摘要

目的
　　 本研究旨在通过体外培养人结肠癌SW620细胞、HCT-8细胞，利用分子生物学实验技术，通过多个角度证实生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式为paraptosis样死亡，并以paraptosis样死亡方式为中心，探讨生育三烯酚诱导结肠癌细胞发生的机制。
　　 方法
　　 1.生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式研究
　　 体外培养人结肠癌细胞，加入不同剂量的δ-生育三烯酚(1、2.5、5、10、15、20、25、30和40μmol/L)和乙醇（溶剂对照）作用24 h后，以MTT实验观察δ-生育三烯酚对SW620细胞存活率的影响;按照5、10、15、20μmol/Lδ-生育三烯酚作用于细胞，以荧光染色(AO/EB染色，DAPI染色)观察细胞死亡情况。
　　 按照20μmol/L剂量加入δ-生育三烯酚，通过加入paraptosis抑制剂放线菌酮观察其对生育三烯酚作用的影响情况，来正面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式中存在paraptosis样死亡。
　　 以不同剂量的δ-生育三烯酚作用于人结肠癌细胞SW620中，检测细胞中caspase-3的活性，并用抗癌阳性药物紫杉醇作为肿瘤细胞凋亡诱导剂作用于SW620细胞中，利用DNA Ladder方法检测细胞中DNA的降解情况，从而证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡并非典型凋亡方式。利用免疫细胞化学检测细胞中细胞自噬标记蛋白LC3的表达情况来观察生育三烯酚诱导人结肠癌细胞产生的这种空泡化死亡现象与细胞自噬的关系，从而排除细胞自噬的可能，从反面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式为paraptosis样死亡。
　　 为了排除细胞系的特异性，本实验中增加了另一种人结肠癌细胞系，HCT-8细胞。将γ-生育三烯酚作用于HCT-8细胞，观察细胞死亡情况，同时检测细胞中caspase-3的活性，作为细胞系平行实验。
　　 2.δ-生育三烯酚诱导人结肠癌细胞SW620死亡的机制研究
　　 体外培养SW620细胞，加入的20μmol/Lδ-生育三烯酚作用24 h后，通过免疫细胞化学和western bloting的方法检测细胞内质网膜蛋白标志物钙连蛋白和内质网应激标记蛋白Bip的表达情况，检测δ-生育三烯酚诱导人结肠癌细胞出现空泡化死亡的现象与内质网应激的关系;在SW620细胞中加入wnt通路抑制剂FH535抑制细胞中wnt通路的激活，观察细胞的形态学变化，并利用western bloting方法检测wnt通路关键因子β-catenin的表达量变化，检测δ-生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡与Wnt通路的关系。
　　 结果
　　 1.与乙醇对照组相比，δ-生育三烯酚作用于结肠癌细胞SW62024 h后，各剂量组均可以使SW620细胞存活率降低(p＜0.05)，且细胞存活率随着δ-生育三烯酚剂量的增加呈现降低的趋势，IC50值为15.18μmol/L。γ-生育三烯酚作用于结肠癌细胞HCT-824 h后，各剂量组均可以使HCT-8细胞存活率降低(p＜0.05)，且细胞存活率随着γ-生育三烯酚剂量的增加呈现降低的趋势，IC50值为32.69 mol/L。
　　 2.生育三烯酚作用于结肠癌细胞SW620和HCT-8后，细胞内均未见细胞核不规整，核染色体DNA浓缩、着边呈新月状，凋亡小体生成等典型凋亡现象，取而代之的是细胞内出现大量空泡。δ-生育三烯酚所致的SW620细胞死亡可被paraptosis抑制剂放线菌酮所抑制。紫杉醇可使SW620细胞核内DNA产生梯度断裂，而δ-生育三烯酚并不能使SW620细胞核内DNA发生梯度降解现象。细胞自噬标记物LC3表达为阴性。证明δ-生育三烯酚诱导结肠癌细胞SW620死亡的方式为paraptosis样死亡而非典型凋亡或细胞自噬。
　　 3.FH535可导致SW620细胞死亡，形态学显示细胞胞浆内出现大量空泡，蛋白定量结果显示wnt通路关键因子β-catenin的表达量下降。证明生育三烯酚诱导结肠癌细胞paraptosis样死亡与抑制细胞中Wnt通路的激活有关。
　　 4.免疫细胞化学结果显示，δ-生育三烯酚作用于结肠癌细胞SW62024 h后，内质网膜钙连蛋白表达阳性，随着生育三烯酚剂量的增大，细胞内质网逐渐形成空泡。内质网应激标记物Bip蛋白表达量增高。证明生育三烯酚诱导结肠癌细胞paraptosis样死亡与细胞内质网应激有关
　　 结论
　　 1.证实生育三烯酚诱导结肠癌死亡的死亡方式中存在paraptosis样死亡。
　　 2.发现δ-生育三烯酚对结肠癌细胞中wnt信号通路的影响以及引起细胞内质网应激可能是其诱导SW620细胞paraptosis样死亡的机制。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡方式的研究

1．1 对象和方法

1．1．1 材料

1．1．2 主要仪器

1．1．3 细胞培养

1．1．4 四噻唑蓝试验(MTT试验)

1．1．5 细胞形态学观察

1．1．6 DNALadder检测

1．1．7 Caspase-3活性检测

1．1．8 免疫细胞化学方法检测细胞死亡方式

1．1．9 统计学处理

1．2 结果

1．2．1 生育三烯酚对结肠癌细胞增殖的影响

1．2．2 生育三烯酚对结肠癌细胞基本形态的影响

1．2．3 δ-生育三烯酚对SW620细胞内DNA的损伤作用

1．2．4 生育三烯酚对结肠癌细胞内Caspase-3活性的影响

1．2．5 免疫细胞化学方法检测细胞死亡方式

1．3 讨论

1．4 小结

二、δ-生育三烯酚诱导SW620细胞死亡的机制研究

2．1 对象和方法

2．1．1 受试物及细胞系

2．1．2 试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 四噻唑蓝试验(MTT试验)

2．1．5 免疫细胞化学方法检测细胞内质网膜蛋白标记物的表达情况

2．1．6 western bloting方法检测细胞内β-catenin蛋白的表达情况

2．1．7 统计学处理

2．2 结果

2．2．1 Wnt通路抑制剂对结肠癌细胞SW620生长的影响

2．2．2 普通光镜观察

2．2．3 DAPI染色观察

2．2．4 免疫细胞化学方法检测细胞内质网膜标记蛋白的表达情况

2．2．5 westem bloting方法检测细胞内关键蛋白的表达情况

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

综述 生育三烯酚的生物学功能及研究进展

致谢