胶质瘤中hMena蛋白表达与恶性胶质瘤侵袭方式的研究

摘要

恶性胶质瘤是常见的中枢神经系统肿瘤，约占颅内肿瘤的12％～15％，肿瘤呈浸润性生长，无明显界限，手术很难完全切除，术后易复发。尽管以手术为主联合放射治疗及化学治疗的综合方案已成为治疗指南，但胶质母细胞瘤病人的预后并没有得到明显改善，平均生存时间只有12～15个月[1]。即使目前在影像导引、神经电生理监测等技术的辅助下可以做到“最大范围的安全切除”，术后辅以放、化疗，但仍然不能阻止肿瘤的复发，而且复发往往出现在肿瘤周围2cm的范围[2]，有研究认为导致肿瘤复发的根源在于脑肿瘤干细胞[3]，而目前的治疗措施难以清除这些细胞。恶性胶质瘤的这一临床特点提示我们，可能有一小部分迁移能力极强的细胞在影像学能够识别肿瘤及手术切除前早已迁移出了肿瘤的原发灶，甚至跨脑叶迁移。我们推测这些细胞即是脑肿瘤干细胞。
　　 恶性胶质瘤的侵袭性生物学行为是肿瘤原位复发及远隔迁移的重要原因。侵袭是一个多因素参与的、多环节的复杂过程[4-6]，其中，细胞的迁移运动是其关键环节。hMena是调节细胞运动的重要分子，其通过调节细胞骨架的重构，在细胞侵袭前缘形成丝状伪足和板状伪足，从而使细胞向前运动。hMena已被证实在包括乳腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中过表达，并与其侵袭能力及恶性程度密切相关[7-12]。
　　 本课题主要讨论hMena在胶质瘤中的表达和对细胞运动的调节以及与肿瘤干细胞的联系，分为以下三个部分：
　　 1.hMena在胶质瘤中的表达及其分布特征。为探讨胶质瘤细胞的迁移方式及hMena的表达与胶质瘤恶性程度的相关性，我们收集了不同病理级别的人脑胶质瘤标本，且通过术中导航精确的选取了恶性胶质瘤中不同部位的组织，进行western blot和免疫组织化学染色分析。Western blot结果发现正常对照脑组织中hMena不表达或呈低表达，恶性胶质瘤中hMena的表达水平显著提高(F=41.18，P<0.0001)；免疫组织化学染色检测发现，hMena在不同级别胶质瘤中的表达差异有统计学意义(H=34.935，P=0.000)，hMena的表达与胶质瘤的分级呈正相关(rs=0.682，P=0.000)，在低级别胶质瘤中仅分布于血管附近，而在高级别胶质瘤中，分布比较广泛。胶质母细胞瘤实体区、肿瘤与脑组织交界区和瘤周2cm处均有阳性细胞染色。在胶质母细胞瘤与脑组织交界区hMena阳性细胞在血管周围呈放射状聚集，类似于假菊形团样排列；在胶质母细胞瘤肿瘤实体区沿传导束纵轴极性排列；在瘤周2cm处单个阳性细胞呈散在分布。在高倍镜下可见hMena浓集于肿瘤细胞的伪足边缘。
　　 2.高表达hMena的细胞与脑肿瘤干细胞的关系。在第一部分研究中发现hMena阳性细胞的分布特征类似于脑肿瘤干细胞在恶性胶质瘤中的分布。为进一步研究上述现象之内在联系，我们通过免疫磁珠分选法从胶质瘤细胞系U251和LN229中分选出了脑肿瘤干细胞并进行培养、鉴定。Western blot法检测CD133+细胞和CD133-细胞中hMena的表达情况，并通过transwell检测其迁移运动能力。结果：经免疫磁珠分选后的脑肿瘤干细胞在36～48h后形成悬浮生长的细胞球，细胞呈圆形，大小一致，折光性强，细胞间连接比较紧密，7～10天可传代一次；免疫荧光检测细胞球表达CD133和nestin；western blot检测发现无论在U251细胞还是在LN229细胞中CD133+细胞和CD133-细胞中hMena的表达均有显著差异(t=26.7，P<0.0001；t=13.08，P=0.0002)；transwell检测发现U251细胞中CD133-细胞组与CD133+细胞组平均每视野实心孔数目为(8.33±0.93)个和(34.11±1.31)个，差异有统计学意义(t=16.09，P<0.0001)
　　 3.敲低hMena的表达降低U251细胞迁移运动能力的体外研究。为探讨hMena的表达在肿瘤细胞迁移运动中的作用及其机制，我们通过siRNA技术，敲低hMena在U251细胞中的表达，transwell法检测细胞的迁移能力，免疫荧光法观察hMena在细胞中的分布以及伪足的形态。结果：转染siRNA敲低U251细胞中hMena的表达后，U251细胞形态变圆，伪足形成减少；transwell检测发现敲低hMena后细胞的迁移运动能力显著减低(t=7.506，P<0.0001)；免疫荧光检测发现对照组细胞中hMena主要集中于板状伪足的边缘，敲低hMena后未见明显的伪足形成。
　　 结论：
　　 1.hMena在正常脑组织中几乎无表达，在不同级别胶质瘤中均有表达，表达水平随着胶质瘤恶性程度的升高而增高。
　　 2.hMena在恶性胶质瘤中的分布特征表现出了恶性胶质瘤的迁移路径和迁移方式，即以微血管为中继站沿血管基底膜和白质纤维束向外迁移。
　　 3.脑肿瘤干细胞高表达hMena，并具有更强的迁移运动能力，恶性胶质瘤血管周围分布的高表达hMena的细胞很可能是从肿瘤实体迁移而来的脑肿瘤干细胞。
　　 4.通过转染siRNA靶向敲低hMena在U251细胞内的表达，从而抑制了细胞板状伪足的形成，降低了细胞的迁移运动能力。