胶质瘤中Rac1蛋白表达和其在恶性胶质瘤侵袭中作用的研究

摘要

恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，约占成人颅内肿瘤的30％～50％。近年来，尽管恶性胶质瘤的治疗已得到了值得关注的发展，但是恶性胶质瘤病人的预后并没有得到明显改善，胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仍不足15个月[1]。恶性胶质瘤分化程度差、缺乏凋亡、富含血管、增殖活性高和呈侵袭性生长。其中侵袭性生长是恶性胶质瘤最突出的生物学行为之一，也是导致肿瘤复发、远隔迁移和难以治愈的主要原因[2]。小部分具有极强迁移和侵袭能力的肿瘤细胞早期即向肿瘤周围及正常脑组织浸润，在远离原发灶处形成大量的微肿瘤，从而免于手术切除和放射暴露[3]。研究认为这些细胞即是脑肿瘤干细胞[4]。
　　恶性胶质瘤的侵袭迁移是肿瘤细胞与宿主细胞及细胞外基质相互作用的复杂过程。肿瘤细胞的侵袭过程一般可分为三个步骤，首先在黏附分子的介导下粘附于细胞外基质(ECM)；在基质金属蛋白酶(MMPs)等作用下降解ECM；通过旁分泌和自分泌的一些因子下细胞肌动蛋白骨架发生重组，形成伪足迁移运动[5]。其中，细胞的迁移运动是其关键环节。细胞的迁移运动由多种信号分子调控，其中肌动蛋白骨架及其调控蛋白最为重要[6][7]。当细胞运动时，肌动蛋白骨架发生动态重组形成片状伪足，为细胞运动提供必要的力量[8]。Rac1是重要肌动蛋白骨架调控蛋白，控制板状伪足的形成。Rac1激活其下游效应因子，并和这些效应因子共同转运至细胞运动前端的细胞膜下，诱导肌动蛋白骨架重组，产生片状伪足，从而促进细胞运动。目前已经发现Rac1在乳腺癌、结肠癌及卵巢癌中表达均明显增高，且其高表达与肿瘤的侵袭转移密切相关[11-13]。
　　本课题主要讨论Rac1在胶质瘤组织中的表达及分布特点；对胶质瘤细胞迁移和侵袭的调节；以及其阳性细胞与胶质瘤干细胞的联系，Rac1在脑胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用，分为以下三个部分：
　　1.Rac1在胶质瘤中的表达及其分布特征。为探讨胶质瘤细胞的迁移方式及Rac1的表达与胶质瘤病理分级的相关性，我们收集2009年6月到2010年6月新诊断的65例人脑胶质瘤标本，每份标本通过术中导航精确的选取了肿瘤中心组织、肿瘤和水肿交界区组织，进行免疫组织化学染色和western blot分析。Western blot结果发现正常对照脑组织中Rac1不表达或呈低表达，恶性胶质瘤中Rac1的表达水平显著提高(F=41.18，P<0.0001)；免疫组织化学染色检测发现，Rac1在不同病理级别胶质瘤中的表达差异有统计学意义(H=34.935，P=0.000)，Rac1的表达与胶质瘤的分级呈正相关(rs=0.682，P<0.01)，胶质母细胞瘤实体区、肿瘤与脑组织交界区均有阳性细胞染色。在胶质母细胞瘤交界区Rac1阳性细胞在血管周围呈放射状和平行于白质纤维束分布。
　　2.Rac1在SDF-1诱导人脑胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用。我们通过特异性的Rac1活性抑制剂下调Racl的活性，探讨Rac1在基质细胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)诱导的人恶性胶质瘤细胞迁移和侵袭中的作用。取U251细胞分为三组，NSC23766预处理组：无血清培养基培养3小时后，于无血清培养基中加入NSC23766(终浓度为100μmol/L)预处理3h后，给予SDF-1(100nmol/ml)处理3min；SDF-1处理组：无血清培养基培养3小时，于无血清培养基中加入20μl PBS替代NSC23766孵育3h后，给予SDF-1(100nmol/ml)处理3min；对照组：无血清培养基培养3小时，于无血清培养基中加入20μl PBS替代NSC23766孵育3h后，给予20μl PBS替代SDF-1对照处理；倒置相差显微镜下观察各组U251细胞的形态变化；细胞迁移实验和Transwell细胞侵袭实验评价不同处理组U251细胞迁移和侵袭能力的差别；Rac1活性实验和Western blotting分别检测不同处理组U251细胞中GTP-Rac1、总Rac1蛋白及其下游蛋白的表达水平；免疫荧光法检测不同处理组U251细胞中伪足形成、Rac1的表达及其细胞内定位。结果：对照组比较，SDF-1(100nmol/ml)刺激细胞伸出巨大的片状伪足；SDF-1处理组细胞迁移和侵袭能力明显强于对照组细胞(P<0.05)；SDF-1对细胞内Rac1活化有明显的刺激作用(P<0.05)，并且细胞运动前端的胞膜下可见Rac1蛋白聚集。Rac1抑制剂NSC23766(100μmol/L)对SDF-1诱导的片状伪足形成有显著的抑制作用；Rac1抑制剂NSC23766对SDF-1诱导的细胞迁移和侵袭有显著的抑制作用(P<0.05)；与SDF-1处理组比较，NSC23766预处理组细胞内Rac1活性明显降低(P<0.05)，且细胞运动前端的胞膜下未见Rac1蛋白聚集。三组中总Rac1蛋白的表达水平没有明显变化(P>0.05)。
　　3.Rac1阳性细胞与胶质瘤干细胞的关系及Rac1在脑胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用。免疫荧光双染色检测胶质瘤组织中Rac1阳性细胞与胶质瘤干细胞的关系。为进一步确定Rac1阳性细胞与胶质瘤干细胞的关系及Rac1在脑胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用，我们通过免疫磁珠分选法分离胶质瘤干细胞，免疫荧光CD133鉴定肿瘤干细胞；特异性的Rac1活性抑制剂NSC23766下调胶质瘤干细胞Rac1的活性；Transwell细胞迁移实验和细胞侵袭实验评价细胞的迁移和侵袭能力；Rac1活性实验检测细胞中Rac1活性；Western blotting检测细胞中hMena和MMP9蛋白的表达水平。结果：免疫荧光双染色显示大部分GSCs也呈Rac1阳性。成功培养出悬浮生长的细胞球，可以连续传代并持续表达神经干细胞标志物CD133；Rac1活性检测显示：CD133+细胞中Rac1-GTP表达水平显著高于在CD133-细胞中的表达，CD133+细胞Rac1活性明显强于CD133-细胞(P<0.05)；与对照组比较，NSC23766处理组中GSCs的Rac1活性明显减弱(P<0.05)。Transwell细胞迁移实验及侵袭实验结果显示，CD133+细胞迁移和侵袭的能力明显强于CD133-细胞(P<0.05)；与对照组比较，NSC23766处理组GSCs迁移和侵袭的能力明显减弱(P<0.05)。Western blotting结果显示：与对照组比较，NSC23766处理组GSCs hMena和MMP9蛋白表达水平明显降低，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1.Rac1在对照脑组织中不表达，在不同级别胶质瘤中均有表达，表达水平随着胶质瘤恶性程度的升高而增高。Rac1阳性细胞在恶性胶质瘤中的分布特征表现出了肿瘤细胞在体内的迁移方式，即沿血管基底膜和以微血管为中继站沿白质纤维束迁移。
　　2.Rac1对SDF-1诱导的人恶性胶质瘤细胞系U251迁移和侵袭具有调控作用。
　　3.脑肿瘤干细胞通过高表达Rac1，从而具有更强的迁移运动能力，血管周围分布的Rac1阳性细胞即可能为从肿瘤实体迁移而来的脑肿瘤干细胞。抑制Rac1活化可以显著地抑制GSCs的迁移和侵袭。