ZEB1在结肠癌血管生成拟态形成中的作用及分子机制探讨

摘要

研究背景和目的：
　　结肠癌是常见恶性肿瘤之一。尽管近年来结肠癌的诊断和治疗方法都有了明显进展，但其死亡率并没有显著改善。血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)是新发现的一种肿瘤血供方式，与肿瘤的侵袭、转移和肿瘤患者预后密切相关。本研究旨在通过研究结肠癌中VM和临床病理参数的关系，分析其临床意义及预后价值，并进一步探讨ZEB1调控的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在结肠癌血管生成拟态形成中的可能作用机制。
　　方法：
　　1)通过CD34/PAS双重染色方法标记结肠癌组织中VM并观察其分布特点，分析其在结肠癌中的临床病理意义和预后价值。
　　2)通过免疫组织化学染色方法检测人结肠癌组织中EMT转录因子ZEB1和EMT相关分子E-cadherin和Vimentin的表达并探讨ZEB1、EMT、VM三者关系。
　　3)通过体外三维培养模型检测三种不同分化程度结肠癌细胞系形成VM管道样结构的能力，并检测内皮相关分子VE-cadherin、Flt-1、Flk-1的表达。
　　4)选取具有管状结构形成能力的结肠癌细胞，利用siRNA技术下调其ZEB1的表达，并观察ZEB1降表达对细胞管状结构形成能力及内皮相关分子表达的影响。
　　5)Western blotting和免疫荧光染色检测ZEB1降表达对结肠癌细胞E-cadherin，Claudin-4，Vimentin，Fibronectin等EMT相关分子表达的影响。
　　6)细胞划痕和侵袭实验检测ZEB1降表达对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
　　7)Western blotting检测ZEB1降表达对结肠癌细胞表达干细胞相关分子CD44和Lgr5表达的影响。
　　结果：
　　1)结肠癌中存在VM这种不依赖于内皮细胞的微循环模式，其发生率为19.2％。
　　2)VM与结肠癌患者的复发/转移、TNM分期和肿瘤分化程度有关(P<0.05)。VM多发生在TNM分期较高，肿瘤分化程度较低的病例，且VM阳性组患者的复发和转移的发生率较高。
　　3)单因素分析结果表明VM、ZEB1表达和结肠癌患者总生存期有关。多因素分析结果表明ZEB1是结肠癌总生存期的独立预后因素(P<0.05)。
　　4)免疫组织化学染色结果表明，VM阳性组结肠癌组织ZEB1表达较高；ZEB1阳性组的上皮标记分子E-cadherin低表达，而间叶标记分子Vimentin的异位表达率高(P<0.05)。
　　5)VM与结肠癌的EMT标志分子表达有关，VM阳性组的上皮标记E-cadherin表达较低，而间叶标记Vimentin的异位表达率高(P<0.05)。
　　6)体外三位培养证实，三种不同分化程度的结肠癌细胞系HT-29，SW480，HCT16中只有低分化的HCT116细胞能够形成VM样管状结构，并表达VE-cadherin、Flk-1、Flt-1等内皮细胞相关分子。
　　7)ZEB1降表达显著抑制HCT116细胞体外管道样结构形成能力，并逆转HCT116细胞的EMT表型，细胞从较强的间充质细胞特征转变为上皮细胞特征。
　　8)ZEB1降表达使HCT116细胞间叶标记分子Vimentin和Fibronectin表达下降，而上皮标记分子E-cadherin，Claudin-4表达上调，且降低其侵袭和迁移能力。
　　9)结肠癌细胞HCT116具有较强的“干性”，可以表达干细胞相关分子CD44和Lgr5。ZEB1降表达显著下调HCT116结肠癌细胞CD44的表达，而对Lgr5表达影响并不显著。
　　结论：
　　1)结肠癌组织中存在VM这种特殊的微循环模式。
　　2)VM与结肠癌侵袭、转移等恶性生物学行为有关，且VM存在提示患者预后不良。
　　3)ZEB1调控的EMT在结肠癌VM形成过程中发挥重要作用。
　　4)VM形成可能和结肠癌细胞的“干性”相关。