淫羊藿甙对MC3T3-E1细胞Smad1,4,5作用的实验研究

摘要

目的：研究淫羊藿甙(icariin，ICA)对体外培养的成骨样细胞MC3T3-E1中Smad1，4，5mRNA及蛋白的影响，探讨ICA刺激成骨细胞生长、分化的分子机制。
　　方法：DMEM高糖、胎牛血清培养下的MC3T3-E1细胞按ICA刺激浓度0、10-9、10-8及10-7M分为四组，以1×105个/孔浓度种植。给药后24、48及72h分别检测细胞OD值；RT-PCR技术测定Smad1、Smad4、Smad5mRNA的量，用Westernblot蛋白印迹方法评价Smad1、Smad4、Smad5蛋白的表达；利用速率法测定ALP活性，计算ALP浓度；经ICA刺激的MC3T3-E1细胞培养21d后，利用Von Kossa's矿化结节染色法处理各浓度组，观察染色结果。
　　结果：24hrs时，ICA各浓度组Smad1、Smad4、Smad5 mRNA表达水平无统计学意义，P值>0.05(Smad1：F=0.064，P=0.961；Smad5：F=1.216，P=0.351，；Smad4：F=0.051，P=0.022)。48、72hrs时，ICA10-9M、10-8M、10-7M浓度组Smad1、Smad5 mRNA表达水平较0M组明显上调，P值<0.05，具有统计学意义(48hrs：Smad1，F=332.435，P=0.000；Smad5，F=373.487，P=0.000；72hrs：Smad1，F=132.356，P=0.000；Smad5，F=102.384，P=0.000)。而smad4在48h时，各浓度组均较24h时表达增强，并且在10-8M时差异明显，具有统计学意义(F=131.654，P=0.000)。至72hrs时，ICA10-9、10-8、10-7M各组，以10-8M组对Smad1、Smad4、Smad5mRNA的上调作用最为显著(P值均<0.05，图表2-c、3-c)。Western blot蛋白印迹显示24、48hrs时，ICA各浓度组Smad1蛋白表达水平无统计学意义，P值>0.05(24hrs：F=0.749，P=0.559；48hrs：F=2.653，P=0.136)，72hrs时，ICA10-9、10-8、10-7M各组蛋白表达水平较0M组明显增加，P值<0.05(F=16.985，P=0.001)，具有统计学意义；Smad5蛋白表达在ICA10-9、10-8、10-7M组分别于24、48、72hrs发现均较0M组上调，其中48hrs、72hrs表达增量明显，P值<0.05，具有统计学意义(24hrs：F=3.762，P=0.060；48hrs：F=14.579，P=0.001；72hrs：F=27.762，P=0.000)；ICA有效刺激组较对照组Smad5蛋白的表达于24hr时即出现差异性，Smad1及Smad4表达的差异性出现于72hrs，相对于48hrs以后出现表达差异的Smad1 mRNA、Smad4 mRNA、Smad5 mRNA而言，蛋白的表达并非平行于Smad1、Smad4、Smad5基因的表达，提示ICA对Smad1、4及5信号的转录后水平的调控；至72hrs时，ICA10-9、10-8、10-7M各组，以10-8M组对Smad1、Smad4、Smad5蛋白的上调作用最为显著(P值均<0.05)。细胞ALP活性检测结果显示MC3T3-E1细胞在淫羊藿甙的刺激下产生ALP的时间依赖性：各组在培养后的3d内，随着时间的增加，LAP产生的总量增加。培养1d时，各组ALP值之间比较差异无统计学意义；培养2d时，10-9、10-8M组ALP值明显高于0、10-7M组(P<0.01).10-9、10-8M组间、0、10-7M组间比较差异无统计学意义(P>0.5).培养3d时，各组ALP值由高到低排列依次为10-8、10-9、0、10-7M.各组均值之间比较差异有统计学意义(P<0.01).ICA对MC3T3-E1细胞钙结节检测的染色结果显示，细胞在淫羊藿甙刺激下培养21d后，Von Kossa’s矿化结节染色法处理各浓度组细胞，钙结节增加从高到低依次为10-8、10-9、0、10-7M。
　　结论：ICA可能通过上调Smad1，4，5mRNA及蛋白的表达来促进成骨细胞分化。

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