靶向bFGF小分子干扰RNA抑制STAT3磷酸化诱导人脑胶质瘤细胞系U251凋亡

摘要

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人恶性程度最高的颅内原发性肿瘤，尽管目前的治疗手段已有很大突破，但是由于GBM颅内高度浸润生长的特性，肿瘤细胞分子调控机制错综复杂，其临床预后仍然很差。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在GBM中高表达，且与肿瘤的生长，增殖，血管发生密切相关，已成为GBM基因治疗中一个有前景的靶向分子。前不久，本课题组成功报道了bFGF小分子干扰RNA的腺病毒载体(Ad-bFGF-siRNA)在体内外实验中均显示出能抑制恶性脑胶质瘤的生长，并增加了胶质瘤细胞系U251的化疗敏感性，然而其确切的分子机制并不清楚。信号转导子与转录激活子3(STAT3)在胶质瘤中过度活化，与肿瘤的分级呈正相关。此外，STAT3也是众多生长因子和细胞因子激活的信号转导通路汇合交叉的中间转录因子，参与调节肿瘤的增殖、生存、转移、血管生成、免疫应答等过程。因此可以假设，Ad-bFGF-siRNA可能通过抑制STAT3通路的磷酸化，从而表现抗增殖，促凋亡的特性。
　　本课题研究，主要包括三个方面：
　　首先，探讨与STAT3有关的信号转导途径的变化。选取多形性胶质母细胞瘤细胞系U251，转染Ad-bFGF-siRNA，分别孵育24、48、72h，提取总蛋白，采用Western blot方法，在三个时间点检测了目的基因STAT3，pSTAT3(Ser727)及pSTAT3(Tyr705)的表达情况，并选取三条与STAT3相关的经典信号通路：JAK-STAT3、Ras-Raf-MEK-MAPK(ERK)及Src信号通路，测定其上游的关键蛋白及下游细胞周期及凋亡蛋白表达量的变化，初步探讨了重组腺病毒Ad-bFGF-siRNA影响STAT3信号转导途径的可能性。整个实验均以DMEM和空载腺病毒孵育组作为对照，结果显示，Ad-bFGF-siRNA能够抑制STAT3蛋白的磷酸化水平，且呈时间依赖性。三个时间点，STAT3总蛋白、ERK1/2总蛋白及JAK2总蛋白量基本保持不变，pSTAT3(Tyr705)的表达从转染24-72h一直受到抑制，pSTAT3(Ser727)表达量在转染24和48h减少，但是转染72h恢复到未转染时的水平，pERK1/2蛋白的变化基本与pSTAT3(Ser727)保持一致，pJAK2的变化与pSTAT3(Tyr705)的变化一致，Src总蛋白和pSrc均只在转染48h表达减少，作为STAT3下游的效应蛋白，CyclinD1和Bcl-xl在转染72h后显著下降，综上，Ad-bFGF-siRNA抑制了U251细胞的JAK2-STAT3、Ras-Raf-MEK-MAPK(ERK)的活化通路，进而抑制了中间转录分子STAT3的磷酸化，和下游的效应分子CyclinD1和Bcl-xL，而对Src的活化可能无影响。
　　其次，探讨细胞外分泌的与STAT3密切相关的细胞因子水平变化。因为IL-6是STAT3的强烈激活物。本课题采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，测定转染Ad-bFGF-siRNA后分别孵育0-24h、24-48h、48-72h细胞上清液中IL-6水平的变化，结果显示，与对照组相比，Ad-bFGF-siRNA能够显著减降低IL-6水平。用重组的人IL-6刺激已用Ad-bFGF-siRNA转染48h的U251细胞，作用24h后，采用Western blot方法检测pSTAT3(Tyr705)和pSTAT3(Ser727)的变化，结果发现，外源性IL-6刺激可逆转Ad-bFGF-siRNA转染诱导的pSTAT3(Tyr705)和pSTAT3(Ser727)的下调。提示，Ad-bFGF-siRNA能够抑制胶质瘤细胞分泌IL-6，而且STAT3活化下调可能与IL-6表达的降低有关。
　　最后，探讨可能的凋亡途径。采用流式细胞仪和免疫荧光检测Ad-bFGF-siRNA处理72h后，线粒体膜电位的变化，并用Western blot方法检测下游的与线粒体途径相关的凋亡分子Cytochrome C、Caspase3、Bax变化，结果显示，Ad-bFGF-siRNA能够显著减低U251细胞线粒体膜电位，并且增加了Cytochrome C、Caspase3、Bax的表达，表明Ad-bFGF-siRNA可能诱导U251细胞发生线粒体相关的凋亡。
　　综上所述，可以得出如下结论：
　　腺病毒介导的bFGF小干扰RNA通过抑制IL-6的分泌，减少了多形性胶质母细胞瘤细胞系U251的STAT3信号通路的活化，包括抑制上游的调节激酶JAK2、ERK及下游的效应分子CyclinD1和Bcl-xl的表达，降低了线粒体膜电位，诱导线粒体相关的凋亡。