无创性延迟肢体缺血预适应对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用效应动力学和线粒体功能的研究

摘要

目的：研究无创性延迟肢体缺血预适应(NDLIP)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。
　　方法：取健康雄性Wistar大鼠，体重250～290 g，随机进行如下分组：对照组，包括(1)假手术组(Sham组)：经冠状动脉左前降支(LAD)下穿线后，旷置；(2)缺血再灌注组(I/R组)：LAD实施30 min缺血，120 min再灌注；(3)心肌缺血预适应组(MIPC组)：心脏LAD先行实施3次5min缺血/5 min再灌注后，立即对LAD实施30 min缺血，120 min再灌注；(4)股动脉缺血预适应组(FAIP)：左肢股动脉先行实施3次5 min缺血/5 min再灌注后，立即对LAD实施30 min缺血，120 min再灌注。
　　连续远端肢体缺血预适应组，包括连续1天(1-d NDLIP)、3天(3-dNDLIP)、7天(7-d NDLIP)组，每组分别在远端肢体缺血预适应后第1天、3天、5天进行缺血再灌注损伤。
　　间断远端肢体缺血预适应组，包括(1)1天NDLIP间隔1天组(1-dNDLIP+1 d INTV)，进行7个循环；(2)1天NDLIP间隔2天组(1-d NDLIP+2dINTV)，进行4个循环；(3)3天NDLIP间隔3天组(3-d NDLIP+3d INTV)，进行3个循环；(4)3天NDLIP间隔5天组(3-d NDLIP+5d INTV)，进行2个循环。监测LAD30min缺血/120 min心功能、ECG变化；TTC染色法测定心肌梗死面积；ELISA法检测血清肌酸激酶MB型同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白Ⅰ活性(cTnI)、心型脂肪酸结合蛋白(H-VABP)、糖原磷酸化酶同工酶B(GPBB)、心肌线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ-Ⅳ；比色法测定心肌线粒体超氧化物岐化酶Mn-SOD活性、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)含量；流式细胞仪检测线粒体跨膜电位、活性氧(ROS)的变化；透射电镜观察线粒体形态变化；免疫印迹法分别检测线粒体型硫氧还蛋白2(Trx2)及其还原酶(TrxP2)；用实时PCR方法检测Trx2mRNA、TrxR2 mRNA和miRNA21、1变化。
　　结果：
　　1.NDLIP对大鼠心肌I/R损伤后心脏生理功能变化的影响连续远端肢体缺血预适应组：与I/R组比较，3-d NDLIP和7-d NDLIP后第1天组S-T段升高幅度降低(0.27±0.078和0.26±0.084 vs0.486±0.129mv，P<0.01)，室早(VPC)和室速(VT)的出现时间推迟(onset of VPC：11.09±2.61和11.59±3.42 vs6.40±1.95 min，P<0.01；onset of VT：11.46±1.84min和12.41±2.65 vs7.87±1.97min，P<0.01)，持续时间缩短(VPC：7.01±2.42和6.88±1.86 vs13.1±4.86min，P<0.01；VT：4.64±2.59和4.06±1.81 vs8.69±2.64min，P<0.01)，左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)、左室内压最大上升速率(dp/dt max)均有所改善(LVSP：100.38±11.75和97.63±5.78 vs85.38±13.17 mmHg，P<0.01；LVEDP：15.76±4.59和15.53±5.10 vs23.33±6.19 mmHg，P<0.01；dp/dt max：3047.25±678.20和3151.38±697.83 vs2415.88±363.46 mmHg，P<0.01)，心肌保护作用与MIPC和FAIP组比较无明显差别(ST：0.27±0.078和0.26±0.084mV，P<0.01；onsetof VPC：11.09±2.61和11.59±3.42 min，P<0.01；onset of VT：11.46±1.84和12.41±2.65 min，P<0.01；duration of VPC：7.01±2.42和6.88±1.86 min，P<0.01；duration of VT：4.64±2.59和4.06±1.81 min，P<0.01)；连续3天和7天NDLIP后第3天组与I/R组相比无明显差别。
　　间断远端肢体缺血预适应组：1-d NDLIP+1d INTV组与MIPC和FAIP组有近似的心肌保护效果(ST：0.27±0.06 mV，P<0.01；onset of VPC：10.80±2.73min，P<0.01；onset of VT：11.35±2.77 min，P<0.01；duration ofVPC：7.37±2.30 min，P<0.01；duration of VT：5.34±2.45 min，P<0.01)，其余各组与I/R组相比无显著性差别。
　　2.NDLIP对大鼠心肌I/R后心肌梗死面积的影响与I/R组比较，3-d NDLIP和7-d NDLIP后第1天组、1-d NDLIP+1 d INTV组心肌梗死面积显著减小(IS/AAR：21.2±5.4％，20.2±4.1％和22.8±8.5％vs34.3±6.6％，P<0.01)，心肌损伤减轻，与MIPC和FAIP组保护作用相当(IS/AAR：19.5±2.3％，19.6±4.6％，P<0.01)，其余各组与I/R组相比无显著性差别。
　　3.NDLIP对大鼠心肌I/R后生化指标的影响与I/R组比较，3-d NDLIP和7-d NDLIP后第1天组、1-d NDLIP+1 d INTV组血清CK-MB、cTnI、H-FABP、GPBB含量显著减少(CK-MB：2411.90±280.80，2184.20±362.50和2483.36±83.42 vs2845.29±142.05，P<0.01；cTnI：3.93±0.45，4.44±0.68和4.29±0.79 vs5.89±0.69，P<0.01；H-FABP：3.48±1.01，3.35±1.08，P<0.05和3.21±0.62 vs4.53±0.42，P<0.01；GPBB：31.28±3.99，31.00±3.38和30.28±4.72 vs36.33±2.58，P<0.01)，与MIPC和FAIP组保护作用相当(CK-MB：2392.24±181.77，2412.78±168.46。P<0.01；cTnI：3.46±0.80，4.40±0.83，P<0.01；H-FABP：3.28±0.93，3.72±0.62。P<0.01；GPBB：31.10±2.33，29.80±3.50，P<0.01)。
　　4.NDLIP对大鼠心肌I/R后ROS和线粒体功能的影响与I/R组比较，NDLIP、MIPC和FAIP组ROS含量明显减少(ROS：11.72±0.64，11.87±0.63和12.06±0.33 vs12.86±0.64，P<0.05)，MDA的生成显著减少(MDA：4.04±0.83，3.95±0.88和3.79±0.83 vs6.23±1.44，P<0.01)：Mn-SOD和GSH-PX活性显著增高(Mn-SOD：30.35±10.15.30.48±6.73和28.62±9.56 vs14.21±6.35，P<0.01；GSH-PX：130.76±12.43，129.04±19.87和136.16±18.14 vs82.13±25.85，P<0.01)；线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅳ的活性明显升高(Ⅰ：8.78±2.57，8.81±2.26和8.35±1.87 vs2.30±1.40，P<0.05；Ⅱ：20.26±4.46，18.89±2.81和20.77±4.71 vs13.6±3.36.P<0.01；Ⅲ：120.10±29.64，117.07±27.12和110.41±35.06 vs67.07±22.02，P<0.01和P<0.05；Ⅳ：39.42±14.20，75.61±14.15和77.44±16.61 vs58.06±15.80，P<0.05)；各预适应组间相比未见显著差别。
　　结论：
　　1.1-d NDLIP+1 d INTV和3-d NDLIP和7-d NDLIP后第1天组明显降低大鼠心肌I/R所致ST-段抬高幅度，推迟缺血期VPC、VT出现时间，缩短持续时间，升高LVSP和dp/dtmax，降低LVEDP，改善心功能，减少I/R所致心肌CK-MB、cTnI、H-FABP和GPBB的释放，缩小心肌梗死面积，保护作用与MIPC和FAIP相当，保护效应至72h消失。结合临床应用前景，确定1-d NDLIP+1d INTV，5 min缺血/再灌，每天3个循环为最佳的方案。
　　2.NDLIP能减少大鼠心肌I/R所致ROS生成，降低MDA含量，减轻氧化损伤，升高线粒体呼吸链复合物Ⅰ～Ⅳ的活性，改善线粒体功能。
　　3.NDLIP能抑制大鼠心肌I/R所致MPTP的开放，增强mitoKATP的开放，调节MPTP和mitoKATP的开放是其心肌保护作用的机制之一。
　　4.NDLIP能增加大鼠心肌I/R损伤后保护性蛋白Trx2和TrxR2蛋白含量和mRNA水平。
　　5.NDLIP能增加大鼠心肌I/R损伤后miRNA1和miRNA21的水平，两者参与了NDLIP的心肌保护。