Fascin与低氧诱导因子HIF-1α相互作用诱导胰腺癌细胞转移机制的研究

摘要

目的：
　　 近年来胰腺癌发病率在国内外均呈稳固上升趋势，且预后极差，五年生存率仅为3％。尽管外科手术和化疗有了很大的改进，但近20年来胰腺癌患者的预后并未有明显的改善，可手术切除的患者生存率仅为17％。因此，更加全面深入地了解胰腺癌的发病机制，探索有效的治疗靶点意义重大。
　　 许多资料显示胰腺癌组织中缺氧诱导因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)的表达与预后密切相关，其蛋白表达强弱与淋巴结转移及临床分期等正相关;另外，细胞骨架蛋白编码基因Fascin在细胞迁移及黏附中发挥重要作用。前期研究我们发现，Fascin在正常胰腺细胞中不表达而在胰腺癌细胞中过表达，但Fascin是否促进胰腺癌侵袭转移及其可能的分子机制尚未阐明。结合我们近期发现:Fascin与缺氧诱导因子HIF-1α在胰腺癌组织中表达正相关，且HIF-1α可能直接调控Fascin的表达，而Fascin又可以反向调节HIF-1α的表达。以上发现使我们推测HIF-1α与Fascin之间存在正反馈环路，介导胰腺癌细胞的侵袭转移。
　　 本课题组拟在前期工作基础上，从细胞水平研究Fascin与HIF-1α的正反馈环路调控机制及其环路中的Fascin在胰腺癌细胞侵袭转移中的作用。本研究将丰富对Fascin基因的功能认识，为胰腺癌侵袭转移的研究提供新的靶点。
　　 方法：
　　 一、Fascin与HIF-1α在胰腺癌组织中的表达情况
　　 1.利用免疫组化方法检测Fascin和HIF-1α在胰腺癌组织中的表达，并初步分析两者表达是否具有相关性
　　 二、明确HIF-1α对Fascin表达的影响及其调节机制
　　 1.采用1％O2、5％CO2、94％N2混合气体培养细胞作为乏氧培养条件，并利用细胞转染和小RNA干扰技术下调HIF-1α的表达后，分别应用Westernblot和RT-PCR检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、VEGF、Fascin及内参β-actin蛋白和基因的表达情况，其中VEGF作为阳性对照。
　　 2.应用过表达HIF-1α载体转染胰腺癌细胞，应用Westernblot和RT-PCR检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、VEGF、Fascin及内参β-actin蛋白和基因的表达情况，其中VEGF作为阳性对照。
　　 3.采用染色质免疫共沉淀技术(CHIP)明确转录因子HIF-1α与Fascin启动子区的结合情况。
　　 4.应用过表达HIF-1α载体、Fascin基因启动子荧光素酶表达载体或其突变体，共同转染胰腺癌细胞，应用双荧光素酶实验分析HIF-1α调控Fascin基因转录激活的能力。
　　 三、明确Fascin对HIF-1α表达的影响及其调节机制
　　 1.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞，改变Fascin的表达后，应用Westernblot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、Fascin及内参β-actin蛋白的表达情况。
　　 2.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞，改变Fascin的表达后，应用Westernblot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α上游的几条信号通路的激活情况，包括AKT、ERK及p38。
　　 3.利用过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞，同时加入某个信号通路的抑制剂，分别应用Westernblot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的HIF-1α、Fascin及内参β-actin蛋白的表达情况。
　　 四、明确Fascin对胰腺癌细胞侵袭能力的影响及其调节机制
　　 1.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞，改变Fascin的表达后，应用Transwell技术检测不同处理条件下胰腺癌细胞的侵袭能力。
　　 2.利用小RNA干扰技术或过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞，改变Fascin的表达后，应用Westernblot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的与侵袭有关的MMP-9、MMP-2以及EMT相关的几个蛋白表达情况。
　　 3.利用过表达Fascin载体转染胰腺癌细胞，同时加入某个信号通路的抑制剂，分别应用Westernblot检测不同处理条件下胰腺癌细胞中的与侵袭有关的MMP-9、MMP-2以及EMT相关的几个蛋白表达情况。
　　 结果：
　　 在胰腺癌组织中，Fascin与HIF-1α表达具有相关性。乏氧信号可以诱导Fascin在mRNA和蛋白水平的表达明显上调，通过RNA干扰技术沉默HIF-1α的表达，可以同时抑制Fascin的表达;深入研究发现，HIF-1α可以结合于Fascin基因启动子区的乏氧反应原件(HRE)，并且可以直接上调Fascin启动子区的活性，引起转录激活。通过RNA干扰技术沉默Fascin的表达或过表达Fascin载体上调Fascin的表达后，HIF-1α的表达出现同样的改变;迸一步研究发现过表达Fascin载体上调Fascin的表达，可以导致PKC的活性增强，进而导致ERK通路的活化，引起HIF-1α表达的上调，PKC或ERK通路的抑制剂可以明显抑制过表达Fascin对HIF-1α的正向调节作用。通过RNA干扰技术沉默Fascin的表达或过表达Fascin载体上调Fascin的表达后，胰腺癌细胞的侵袭能力发生明显改变，通过Wetsernblot分析，Fascin可以上调MMP-2的表达，ERK通路的抑制剂可以明显抑制过表达Fascin对胰腺癌侵袭能力和MMP-2表达的正向调节作用。
　　 结论：
　　 HIF-1α可以结合于Fascin的启动子区，激活Fascin转录进而导致Fascin的表达上升;Fascin的表达上升可以通过活化PKC导致ERK通路的活化，反向导致HIF-1α的表达上调，从而形成了一个正反馈环。其结果是导致了下游的MMP2表达的上调，进而使胰腺癌细胞的侵袭能力不断累积上升。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、Fascin与HIF-1α在胰腺癌组织中的表达

1．1 对象和方法

1．1．1 实验对象

1．1．2 实验方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

二、HIF-1α对Fascin表达的影响及其调节机制

2．1 对象和方法

2．1．1 实验对象

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．2．1 乏氧状态下Fascin及HIF-1α在胰腺癌细胞中的蛋白表达

2．2．2 乏氧状态下Fascin及阳性对照VEGF在胰腺癌细胞中的mRNA表达

2．2．3 RNA干扰HIF-1α对Fascin表达的影响

2．2．4 过表达HIF-1α对Fascin表达的影响

2．2．5 HIF-1α直接结合于Fascin基因启动子区

2．2．6 HIF-1α调节Fascin转录的具体模式分析

2．3 讨论

2．4 小结

三、Fascin对HIF-1α表达的影响及其调节机制

3．1 对象和方法

3．1．1 实验对象

3．1．2 实验方法

3．2 结果

3．2．1 干扰或过表达Fascin对HIF-1α在胰腺癌细胞中的蛋白表达的影响

3．2．2 干扰Fascin后胰腺癌细胞内主要的HIF-1α上游信号通路的改变

3．2．3 过表达Fascin后加入ERK通路抑制剂对胰腺癌细胞内HIF-1α表达的影响

3．2．4 Fascin激活ERK通路的机制研究

3．3 讨论

3．4 小结

四、胰腺癌细胞中Fascin对侵袭能力的影响及其调节机制

4．1 对象和方法

4．1．1 实验对象

4．1．2 实验方法

4．2 结果

4．2．1 干扰Fascin对胰腺癌细胞侵袭能力的影响

4．2．2 干扰Fascin对胰腺癌细胞内与侵袭能力相关因子的影响

4．2．3 过表达Fascin对胰腺癌细胞侵袭能力及MMP-2表达的影响

4．2．4 Fascin影响胰腺癌细胞侵袭能力的具体机制研究

4．3 讨论

4．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 Fascin蛋白与恶性肿瘤

致谢