干扰乳腺癌细胞BAG-1基因表达及其对吉非替尼敏感性影响的基础研究

摘要

目的:
　　 乳腺癌的发生是一个多因素、多步骤的复杂的过程。在基因水平上明确肿瘤的发生发展并寻求治疗手段，尤其是癌基因激活，抑癌基因的失活及其相关相关药物作用通路，是近年来的研究热点。大量研究表明，凋亡障碍及其机制具有重要意义并受到了许多研究者的重视和关注。本文研究BAG-1基因(Bcl-2associatedathanogene-1)在乳腺癌细胞中的表达，分析干扰BAG-1基因表达与乳腺癌细胞对吉非替尼的敏感性关系及BAG-1参与肿瘤中表面生长因子受体1、2的表达过程。探讨乳腺癌靶向治疗敏感性和耐药性的影响因素。
　　 方法:
　　 培养应用乳腺癌细胞株MDA-MB-231、T47D，通过基因干扰(siRNA)降低BAG-1的表达，并通过real-timePCR和Westernblot方法验证在基因干扰效率。应用MTT法和FACS(流式细胞术)等分别检测BAG-1降表达的乳腺癌细胞对吉非替尼（表面生长因子受体1抑制剂）的药物反应性、凋亡率变化和周期阻滞情况。分别应用real-timePCR和Westernblot方法检测相关基因EGFR及HER-2在mRNA和蛋白水平的表达变化。
　　 结果:
　　 1.应用有效序列BAG-1siRNA转染乳腺癌细胞MDA-MB-231、T47D，在BAG-1SiRNA50nM转染48h后，通过westernblot和real-timePCR实验中检测转染组BAG-1蛋白和mRNA水平表达明显低于对照组(P＜0.05)。在不同时间，应用不同浓度梯度的吉非替尼处理BAG-1降表达前后的MDA-MB-231、T47D，随着浓度的升高，细胞的存活率亦逐渐降低，BAG-1降表达组的细胞生长率率明显低于对照组（P＜0.05）。
　　 2.通过FACS(流式细胞术)检测MDA-MB-231、T47D在BAG-1si-RNA干扰实验中对gefitinib10uM的反应中不同的细胞的凋亡情况(MDA-MB-231:17.57％vs31.23％,P＜0.001;T47D:11.43％vs19.87％,P＜0.001)和周期G0/G1期阻止情况（MDA-MB-231:72.06％vs87.05％,P＜0.05;T47D:61.91％vs69.82％,P＜0.05）。在吉非替尼(gefitinib)作用于乳腺癌细胞中降低乳腺癌细胞中的BAG-1的表达能够使癌细胞的细胞出现凋亡率和G0/G1期的阻滞程度的增大，进而出现药物增敏作用。
　　 3.在MDA-MB-231和T47D的BAG-1siRNA实验中，与对照组相比，BAG-1siRNA转染组BAG-1蛋白和mRNA水平表达明显降低，而两组细胞的EGFR蛋白和mRNA表达水平均出现升高;但在MDA-MB-231细胞中HER-2表达增高但无明显差异，仅在T47D中则出现HER-2表达差异。
　　 结论:
　　 1.在乳腺癌细胞中，通过基因干扰技术减低BAG-1表达能够增强吉非替尼(gefitinib)对细胞的生长抑制，增加乳腺癌细胞凋亡率和发生细胞周期阻滞进而抑制肿瘤细胞的增值，证实BAG-1是针对为乳腺癌治疗，尤其是针对表皮生长因子受体1的一个潜在治疗增敏靶点。
　　 2.BAG-1在乳腺癌细胞中的表达下降能使细胞EGFR的mRNA和蛋白的表达增加，而基因干扰BAG-1表达后上调HER-2的表达，但无显著统计学差异，BAG-1降低后HER-2的表达的是否增加以及相关通路需要进一步研究。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1 材料与试剂

1．1 细胞株

1．2 主要仪器

1．3 实验试剂

1．4 溶液配制

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 小RNA基因干扰实验

2．3 实时定量PCR检测逆转录聚合酶链反应

2．4 Western blot蛋白印迹

2．5 检测细胞增值能力(MTT法)

2．6 用流式检测细胞的凋亡

2．7 用流式检测细胞的周期

3．统计学方法

结果

1．小RNA干扰乳腺癌细胞BAG-1表达实验

2．MTT检测药物作用下细胞增值能力

3．检测药物作用下细胞凋亡

4．检测药物作用下细胞周期变化

5．BAG-1与表面生长因子受体EGFR、HER-2表达的关系

讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 BAG-1基因与恶性肿瘤

致谢