抗人CD40单链抗体噬菌体展示文库的构建及初步鉴定

摘要

目的:构建抗CD40单链抗体(single chain Fragment variable， ScFv)的噬菌体展示文库并进行初步鉴定，为下一步获取高亲和力抗CD40单链抗体奠定基础。
　　方法:①人重组CD40蛋白颈背部皮肤皮下注射免疫BALB/c小鼠②提取免疫小鼠脾脏总RNA，采用反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法获取CD40抗体的重链可变区(Heavy Variable，VH)及轻链可变区(Light Variable，VL)基因序列。③重叠PCR(overlap-PCR OE-PCR)的方法构建单链抗体序列全长④通过双酶切及定向克隆技术将ScFv克隆入噬菌粒pCANTAB5E，构建重组质粒pCANTAB5E-ScFv⑤将构建质粒转化大肠杆菌TG1，构建原核表达文库。⑥使用M13KO7辅助噬菌体拯救TG1文库，进而构建CD40-ScFv的噬菌体展示文库。
　　结果:①成功获取免疫小鼠体内的VH、VL片段基因序列②重叠PCR构建单链抗体全长，凝胶电泳检测条带大小约750bp，条带清晰独立，证实ScFv拼接成功③构建的重组质粒pCANTAB5E-ScFv经SfiⅠ与NotⅠ双酶切鉴定，凝胶电泳于750bp、4200bp处可见两条条带，证实质粒构建成功。④使用辅助噬菌体M13KO7侵染转化重组质粒TG1，成功构建CD40-ScFv的噬菌体展示文库，菌液涂板测定库容量约为1.75×106。⑤随机挑取阳性克隆8个扩增经测序分析，插入序列的长度及顺序正确，拼接的单链抗体序列符合鼠源抗体的基本框架结构，且具体序列各自不同。
　　结论:成功构建CD40-ScFv的噬菌体展示文库，并对库容及其多样性进行了初步鉴定，满足后期噬菌体展示淘选要求。为下一步使用噬菌体展示技术获取高亲和力抗CD40单链抗体奠定基础。

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