NDRG1基因启动子甲基化在前列腺癌中的初步研究

摘要

目的:
　　前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，欧美等发达国家是前列腺癌的高发区，而我国发病率明显低于上述地区。近年来随着环境、饮食结构、生活方式的改变等，我国前列腺癌的发病率也呈逐年上升趋势，严重危害着广大男性的健康。
　　肿瘤的发生、发展是多种因素通过不同途径激活原癌基因和（或）使抑癌基因失活，导致细胞的增殖和凋亡失去理性控制。DNA甲基化是目前表观遗传学的重要研究内容，特别是CpG岛甲基化异常所致的抑癌基因失活及癌基因激活。最近研究证明，前列腺癌中基因表型的改变，在肿瘤的发生发展中起重要作用，特别是抑癌基因DNA的甲基化致表达异常，成为研究重点。NDRG1基因是近年来发现的抑癌候选基因，NDRG1蛋白有去磷酸化作用，可以调节细胞内信号蛋白分子酪氨酸的磷酸化水平，抑制细胞的增殖、分化和活性等。
　　虽然NDRG1基因对肿瘤的抑制功能已得到证实，但在前列腺癌中的作用机制仍不十分清楚，其表达的调控机制等也尚未完全明确。本研究通过检测前列腺癌细胞系、人正常前列腺细胞、前列腺癌组织和良性前列腺增生组织中NDRG1基因启动子的甲基化状态，并对前列腺癌细胞系进行去甲基化干预后，观察肿瘤细胞增殖和凋亡情况及NDRG1基因mRNA的表达情况。探讨NDRG1基因启动子甲基化在前列腺癌发生发展中的作用，为前列腺癌的诊断和治疗提供新的依据和方向。
　　方法:
　　1.运用生物信息学及相关软件，获取NDRG1基因的5'上游序列，预测启动子区域和CpG岛位置，参照相关文献设计引物。
　　2.应用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite-sequeneing PCR，BSP)检测4种前列腺癌细胞系(PC3、LNCaP、DU145和22RV1)和1种人正常前列腺细胞系RWPE-1、10例前列腺癌组织和10例良性前列腺增生组织中NDRG1基因启动子的甲基化状态并比较筛选出甲基化程度最高的细胞系。
　　3.运用不同浓度（5，10，15，20μmol/L）甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)分别作用前列腺癌细胞(DU145)24，48，72小时，用RT-PCR法测定用药前后DU145细胞中NDRG1基因mRNA表达水平的变化。
　　4.运用BSP法检测用5-氮杂胞苷处理前后DU145中NDRG1启动子甲基化状态的差异，MTT法检测其对细胞增殖能力的影响。
　　结果:
　　1.生物信息学分析结果显示，NDRG1启动子区域位于-3720bp～7079bp，长度为3360bp; NDRG1基因启动子序列存在四个CpG岛，位于577bp～24455bp，1868bp。
　　2.根据BSP结果计算NDRG1启动子甲基化率，4种前列腺癌细胞系的甲基化率分别为24.8％(PC3)、36.2％(22RV1)、48.6％(LNCaP)、69.5％(DU145)，1种人正常前列腺细胞系的甲基化率4.8％(RWPE-1)，10例前列腺癌组织的甲基化率为(48.6±5.3)％，10例良性前列腺增生组织的甲基化率为(4.3±2.1)％，两者差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　3.前列腺癌细胞DU145经10mol/L的5-Aza-CdR处理后，NDRG1基因启动子的甲基化率由干预前的69.5％下降至11.4％，而NDRG1基因mRNA表达明显增高，随剂量的增加表达增强。
　　4.MTT实验结果表明，5-氮杂胞苷能明显抑制前列腺癌细胞DU145的增殖，并在一定范围与药物浓度及作用时间呈正相关。
　　结论:
　　NDRG1基因启动子区CpG岛在前列腺癌细胞和组织中呈高甲基化状态，NDRG1基因启动子的甲基化是其在前列腺癌中低表达的原因之一。甲基转移酶抑制剂能显著降低前列腺癌细胞NDRG1基因启动子甲基化率并恢复其mRNA的表达。这些实验结果表明NDRG1基因表达增加与前列腺癌恶性生物学行为相关，是前列腺癌发生进展和不良预后的一个可供参考的预测指标。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

第一部分 NDRG1基因启动子在前列腺癌中的甲基化状态

1．1 材料和方法

1．1．1 实验材料

1．1．2 实验方法

1．1．3 统计学处理

1．2 结果

1．2．1 基因生物信息学分析和组织鉴定

1．2．2 NDRG1基因启动子甲基化状态

1．2．3 NDRG1基因启动子区甲基化程度比较

1．3 讨论

1．4 小结

第二部分 5-氮杂胞苷对前列腺癌细胞NDRG1基因去甲基化作用的研究

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 统计学处理

2．2 结果

2．2．1 去甲基化干预对DU145细胞NDRG1基因mRNA表达的影响

2．2．2 MTT法检测去甲基化对DU145细胞增殖能力的影响

2．2．3 去甲基化干预对DU145细胞NDRG1甲基化状态改变

2．3 讨论

2．4 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 DNA甲基化与前列腺癌的研究

致谢