高糖预处理对单核细胞应答金黄色葡萄球菌刺激的影响

摘要

目的:
　　观察高糖状态下金黄色葡萄球菌(SA)诱导的人单核细胞株THP-1在不同时间段的凋亡特点，以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达和分泌规律。探讨高糖预处理对单核细胞以及单核细胞应答金黄色葡萄球菌刺激的影响。
　　方法:
　　以高糖预处理的THP-1单核细胞为研究对象，分别以热灭活金黄色葡萄球菌(HKSA)和金黄色葡萄球菌(SA)活菌为刺激条件。
　　1.体外培养THP-1细胞，采用2×2析因分析实验设计，以高糖、细菌2个因素，每个因素2个水平交叉分为对照组、高糖组、细菌组和高糖细菌组。各组提取细胞总RNA，应用半定量逆转录聚合酶链反应(SQ-RT-PCR)法，检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白细胞介素(IL)-1β的表达。
　　2.THP-1单核细胞分别以5.5mmol/L葡萄糖（低糖，LG）和25.0mmol/L葡萄糖（高糖，HG）体外培养12h～8d。将HG和LG培养6d的单核细胞加入HKSA（细胞、细菌比1∶10）。分别于HKSA加入前和加入后2～48h检测细胞凋亡、IL-1β蛋白、iNOS和IL-1βmRNA表达。细胞凋亡采用AnnexinⅤ与PI双染法，流式细胞技术检测;IL-1β蛋白分泌采用ELISA法检测;提取细胞总RNA，反转录生成cDNA后，采用实时定量逆转录聚合酶链反应(Rt-PCR)法，检测iNOS和IL-1βmRNA表达情况。
　　3.分别以LG和HG体外培养THP-1单核细胞12h～7d。将HG和LG培养6d的单核细胞加入SA（细胞、细菌比1∶5）。分别于SA加入前和加入后1～24h检测细胞凋亡、iNOS和IL-1β表达。细胞凋亡采用AnnexinⅤ与PI双染法，流式细胞技术检测;iNOS蛋白表达采用Western blot技术检测;IL-1β检测采用ELISA法检测;检测iNOS和IL-1βmRNA表达采用Rt-PCR法。
　　4.体外培养单核细胞株THP-1，分别以LG和HG培养7d。取单核细胞悬液（细胞数约5×106/ml）和SA(2×107CFU/ml)，加调理素（混合的新鲜人血清），置37℃振荡孵育。取悬浮细胞混合液，以平皿接种法计算杀菌率(％)。
　　结果:
　　1.高糖、细菌以及两者交互效应均影响THP-1人单核细胞表达iNOS和IL-1β。高糖组与对照组比较细胞表达iNOS和IL-1β均减弱(P＜0.01);高糖细菌组表达iNOS和IL-1β均显著低于细菌组(P＜0.01)。细菌组与对照组比较iNOS和IL-1β表达均增加;高糖细菌组与细菌组比较IL-1β表达增加，iNOS表达变化不显著。
　　2.高糖刺激THP-1单核细胞12～48h后IL-1β蛋白、iNOS和IL-1βmRNA表达较刺激前显著增加(P＜0.05)，iNOS和IL-1βmRNA表达在24h达最高值，IL-1β蛋白分泌48h达高峰。细胞凋亡在高糖刺激48h～4d较刺激前显著增加(P＜0.05)。两组细胞加入HKSA后6～48h表达iNOS和L-1β显著高于刺激前(P＜0.01)，24h达高峰，48h表达下降;IL-1β蛋白分泌在48h达最高值。两组细胞凋亡率在加入HKSA后12h、24h、48h逐渐增加(P＜0.01)。单核细胞加入HKSA前和加入HKSA后12h，高糖组与低糖组比较，高糖组IL-1β蛋白、iNOS和IL-1βmRNA表达均低于低糖组，凋亡率高于低糖组(P＜0.05)。
　　3.THP-1单核细胞分别于低糖和高糖环境培养7天后，iNOS和IL-1β表达均减少(P＜0.05)。
　　4.THP-1单核细胞分别于低糖和高糖环境培养6天后，两组细胞分别加入SA（细胞、细菌比1∶5），iNOS和IL-1βmRNA表达在1h显著增加，6h达到最高水平，24h减低。两组细胞凋亡率在加入SA后1h、6h、12h、24h逐渐增加（P＜0.01）;两组细胞24h凋亡率分别为48.24±6.32％(LG)和61.37±7.14％(HG)(P＜0.05)。高糖组与低糖组比较，高糖组iNOS和IL-1β表达均低于低糖组，凋亡率高于低糖组(P＜0.05)。
　　5.THP-1单核细胞分别于低糖和高糖环境培养24h后，高糖组吞噬功能显著低于低糖组(P＜0.05)，吞噬率分别为93.21±8.75％和82.41±7.12％。与吞噬率一致，高糖组杀菌率显著低于低糖组（P＜0.05），杀菌率分别为85.32±7.33％和70.32±5.95％。
　　结论:
　　高糖和(HK)SA对单核细胞表达iNOS和IL-1β的影响与刺激时间有关;以SA刺激处于高糖状态的单核细胞时，高糖因素可以增加细胞凋亡率，降低iNOS和IL-1β表达。高糖状态可以减弱单核细胞吞噬杀菌功能。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

研究材料与实验技术

1 研究材料

2．实验技术

一、高糖和金黄色葡萄球菌及两者交互效应对单核细胞表达iNOS和IL-1βmRNA的影响

1．1 对象和方法

1．1．1 细胞培养

1．1．2 细菌悬液和调理素

1．1．3 实验分组

1．1．4 iNOS表达测定

1．1．5 IL-1β表达测定

1．1．6 统计学分析

1．2 实验结果

1．2．1 单变量多因素方差分析结果

1．2．2 单因素方差分析结果

1．3 讨论

1．4 小结

二、高糖预处理对单核细胞应答HKSA刺激的影响

2．1 实验方法

2．1．1 培养条件和实验分组

2．1．2 iNOS、IL-1β表达测定

2．1．3 IL-1β分泌检测

2．1．4 细胞凋亡检测

2．1．5 统计学方法

2．2 结果

2．2．1 高糖对THP-1单核细胞凋亡及表达iNOS、IL-1β mRNA和IL-1β蛋白的影响

2．2．2 高糖对HKSA诱导THP-1单核细胞凋亡及表达iNOS、IL-1β mRNA和IL-1β蛋白的影响

2．2．3 单核细胞表达iNOS、IL-1βmRNA相关性分析

2．3 讨论

2．4 小结

三、高糖预处理对单核细胞应答金黄色葡萄球菌刺激的影响

3．1 实验方法

3．1．1．培养条件和实验分组

3．1．2 iNOS、IL-1βmRNA表达测定

3．1．3 iNOS、IL-1β检测

3．1．4 细胞凋亡检测

3．1．5 杀菌率检测

3．1．6．统计学方法

3．2 结果

3．2．1 高糖对THP-1单核细胞表达iNOS和IL-1β的影响

3．2．2 高糖对THP-1单核细胞凋亡的影响

3．2．3 高糖对SA诱导THP-1单核细胞表达iNOS、IL-1β的影响

3．2．4 高糖对SA诱导THP-1单核细胞凋亡的影响

3．2．5 高糖对THP-1单核细胞吞噬杀菌功能的影响

3．3 讨论

3．4 小结

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述

一、细菌耐药性及其预防

二、万古霉素耐药金葡菌研究进展

三、糖尿病足感染的细菌学分析及治疗

致谢