人牙龈成纤维细胞的多分化潜能及骨形成蛋白-2和地塞米松影响其成骨能力的研究

摘要

目的:
　　研究人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，hGFs）是否具有成骨、成软骨和成脂的多向分化潜能，同时检测骨形成蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和地塞米松（dexamethasone，DEX）对体外培养的hGFs的细胞增殖活性以及成骨诱导分化的影响。
　　方法:
　　选择就诊于天津医科大学口腔颌面外科的志愿者（18-25岁），经志愿者知情同意后，拔除阻生齿（无龋病、无牙周病），收集术中分离的新鲜健康牙龈组织。采用组织块法提取hGFs，取第3代细胞用于实验。实验分为两部分。第一部分，培养至第3代的人牙龈成纤维细胞，进行多分化包括成骨、成软骨和成脂肪诱导分化研究，分别以DMEM（低糖）与3％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）进行培养作为对照组，分别进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、茜素红染色、阿利新蓝染色和油红 O染色检测成骨、成软骨和成脂分化情况。成骨诱导培养基成分包括DMEM培养基（低糖）、3%FBS、10-2 mol/Lβ-甘油磷酸钠、5 mg/L抗坏血酸、2×10-3 mol/L L-谷氨酰胺以及10-7 mol/L DEX；成软骨诱导培养基成分包括DMEM（低糖）、3%FBS、50 mg/L抗坏血酸、6.25 mg/L胰岛素及10μg/L转化生长因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）；成脂诱导培养基成分包括DMEM（低糖）、3%FBS、10-6 mol/L DEX、10-5 mol/L胰岛素、0.5 mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌（3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）及2×10-4 mol/L吲哚美辛。第二部分，分5组培养：A组为DMEM培养组，仅使用DMEM培养基（低糖）与3% FBS进行培养；B组为基础骨诱导培养组；C组为基础骨诱导+10-7 mol/L DEX培养组；D组为基础骨诱导+50μg/L BMP-2培养组；E组为基础骨诱导培养基+10-7 mol/L DEX+50μg/L BMP-2培养组。MTT法检测细胞增殖活性，ALP染色、茜素红染色、逆转录多聚酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测细胞成骨分化情况。
　　结果：
　　(1)培养至7d的ALP染色结果显示成骨诱导组可见大量细胞内染色的蓝紫色沉淀，对照组无沉淀产生；培养至28d，可见成骨诱导组细胞周围有大量红染的钙结节沉积，对照组无红染的钙结节。培养至14d，成软骨诱导组阿利新蓝染色见细胞染色的蓝色沉淀，成脂诱导组细胞内可见油红 O染色呈红色的脂肪滴，对照组的hGFs阿利新蓝和油红O染色均成阴性。
　　(2) MTT结果显示：hGFs在所有培养条件下均能够稳定生长，各组细胞在相同时间的增殖活性无明显差异（P＞0.05）。
　　(3)培养至7d的细胞，碱性磷酸酶染色结果显示：A组无明显蓝紫色沉淀，B组和D组可见少量细胞染色的蓝紫色沉淀，C组和E组可见大量蓝紫色沉淀，E组染色较C组稍深。
　　(4)培养至28d的细胞，茜素红染色结果显示：A组无钙结节形成，其它组均有大量钙结节形成，E组的钙结节量最多，其次为C组，再次是D组、B组。
　　(5) RT-PCR结果显示：同一时间，E组的ALP、胶原蛋白I（collagen1，Col1）、runt相关转录因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）表达量均为最高（P<0.0001）；C组的ALP、Col1表达量仅次于E组（P<0.0001）；而第21d，D组Runx2（P<0.05）。7d时，除E组外，各组Runx2表达量均无明显差异；14d时，D组Runx2表达量仅次于E组（P<0.05）；21d时，C组Runx2表达量仅次于E组（P<0.05）。
　　结论:
　　(1) hGFs具有成骨、成软骨和成脂分化的多向分化潜能。
　　(2) BMP-2和DEX对hGFs的细胞增殖无明显影响。
　　(3)单独及联合应用DEX、BMP-2能够促进hGFs的碱性磷酸酶活性和钙结节的形成，两者联合的作用更强，提示两者联合能更有效地促进hGFs成骨分化。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、人牙龈成纤维细胞多向分化潜能的研究

1.1 实验准备

1.2 对象和方法

1.3结果

1.4 讨论

1.5 小结

二、BMP-2联合DEX对人牙龈成纤维细胞的影响

2.1 实验准备

2.2 对象和方法

2.3结果

2.4 讨论

2.5 小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 诱导性多潜能干细胞体外诱导及重编程模式

致谢