重组人骨形成蛋白-2和人牙周膜成纤维细胞对破骨样细胞形成的影响及作用机理

摘要

正畸牙齿移动的生物学基础是牙周组织主导的骨吸收和骨形成活动。牙周膜细胞是正畸力的直接效应细胞，是一组有异质性的细胞群，其中的一些细胞可以分化为成骨细胞和成牙骨质细胞，同时牙周膜成纤维细胞还可以通过表达骨保护因子（osteoprotegerin，OPG）和破骨细胞分化因子（receptor activator nuclear factor kappa B ligand，RANKL）来调节破骨细胞的活动。成骨/基质细胞与前体破骨细胞（osteoclast precursors，OCP）的直接接触是破骨细胞（osteoclast，OC）形成、分化过程中必不可少的因素之一，而且骨吸收刺激因子作用于成骨/基质细胞后，其产生RANKL与前体破骨细胞及破骨细胞膜上表达的RANKL受体（receptor activator of nuclear factor-κB receptor，RANK）结合，引起级联反应，使破骨细胞分化、成熟、激活，并促进其从骨膜释放、转移、粘附到骨质表面。除了RANKL，成骨/基质细胞还生成与之对应的OPG，可竞争性地与RANK结合，以封闭RANKL与RANK的结合，抑制破骨细胞的分化成熟，抑制骨吸收功能。 骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）属于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，是诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）之一，可促进牙槽骨、牙骨质和牙周韧带的再生。国外学者研究认为，BMP-2具有诱导和调节破骨细胞分化和活化骨吸收功能的作用，并且通过RANKL/OPG途径诱导成骨/基质细胞参与破骨细胞的活化，但是国内关于BMP-2对人牙周膜成纤维细胞参与的破骨细胞活化的影响尚未见报道。 牙周膜细胞是正畸施力后的主要效应细胞，在压力和张力的作用下，牙槽骨同时开始骨吸收和骨形成的骨改建过程，BMP-2同时具有成骨和诱导破骨细胞分化的作用，明确其对牙周膜细胞的作用对于了解正畸牙齿的移动速度、矫治的效率、牙槽骨的改建以及矫治结束后的稳定性均有重要意义。 本实验在体外将分离培养的人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）和从人全血中分离出的单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）进行直接共培养，探讨重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）和人牙周膜成纤维细胞在破骨样细胞形成中的作用；探索体外分离培养的人牙周膜成纤维细胞OPG和RANKL的表达，并探讨rhBMP-2对其表达的影响。本研究将实验分为以下两部分： 一、rhBMP-2和人牙周膜成纤维细胞对体外诱导破骨样细胞生成的影响。 目的: （1）建立人牙周膜成纤维细胞和人外周血中单个核细胞的直接共培养模型，观察人牙周膜成纤维细胞在破骨样细胞诱导形成过程中的作用； （2）观察rhBMP-2对TRAP（tartrate-resistant acidic phosphatase）阳性单个核细胞和TRAP阳性多核破骨样细胞形成的影响； （3）探讨rhBMP-2和人牙周膜成纤维细胞对破骨样细胞诱导形成的影响及其可能的作用机制。 方法: 组织块法体外常规培养人牙周膜成纤维细胞，同时利用Ficoll-Paque Plus淋巴分离液分离人外周血单个核细胞。在含有1×10-8mol/L1α，25-（OH）2D3与1×10-7mol/L地塞米松的培养液中，将单个核细胞进行单独培养或与牙周膜成纤维细胞直接共培养18天，同时设置rhBMP-2（+）和rhBMP-2（-）组，以后每3天进行换液，每次半换液，观察TRAP阳性单个核细胞和TRAP阳性多核破骨样细胞的数量，并且分析rhBMP-2和人牙周膜成纤维细胞对其影响。 结果: （1）通过TRAP染色法和牙本质上的骨吸收陷窝证明了人牙周膜成纤维细胞和外周血单个核细胞直接共培养诱导破骨样细胞的模型是可行的； （2）共培养体系中，rhBMP-2（+）组与rhBMP-2（-）组的TRAP阳性多核细胞数目相比较，差异具有统计学意义（t=71.070，P<0.001）；共培养组与单个核细胞组之间的TRAP阳性多核细胞数目相比较，差异具有统计学意义（t=39.000，P<0.001）；共培养组受rhBMP-2诱导后，TRAP阳性多核细胞数目显著增加（t=17.079，P<0.001）； （3）rhBMP-2与人牙周膜成纤维细胞在TRAP阳性多核细胞的形成中发挥重要作用；同时，rhBMP-2与人牙周膜成纤维细胞联合作用能促进TRAP阳性多核细胞的生成。 结论： （1）在与人牙周膜成纤维细胞直接共培养的前提下，人外周血单个核细胞可分化为TRAP阳性的破骨样细胞； （2）rhBMP-2有促进破骨样细胞生成的作用，其作用机制可能是通过人牙周膜成纤维细胞间接作用于人外周血单个核细胞。 二、人牙周膜成纤维细胞OPG和RANKL的表达以及rhBMP-2对其表达的影响。 目的: （1）检测人牙周膜成纤维细胞OPG和RANKL在基因水平和蛋白水平的表达； （2）观察rhBMP-2对人牙周膜成纤维细胞中OPG和RANKL蛋白表达的影响，从而探讨rhBMP-2对破骨样细胞生成的作用机制。 方法: 采用组织块法体外培养人牙周膜成纤维细胞，选取生长状态较好的细胞，利用免疫细胞化学检测正常基础状态下，人牙周膜成纤维细胞上RANKL蛋白的表达，以酶联免疫吸附实验（ELISA）检测OPG蛋白的表达。然后利用100ng/mlrhBMP-2对人牙周膜成纤维细胞进行诱导，分别于诱导3d、6d、9d、12d、15d、18d时收集细胞培养液上清，检测分泌型OPG蛋白表达的变化。 结果: （1）人牙周膜成纤维细胞膜上和胞浆中表达RANKL蛋白，符合其跨膜蛋白的特征；同时也分泌OPG蛋白到培养液中； （2）在18天的诱导周期中，虽然OPG蛋白的分泌量由于细胞增殖呈升高趋势，但rhBMP-2（+）组的增长趋势低于rhBMP-2（-），说明rhBMP-2的诱导可显著减少OPG蛋白的分泌（F=45.433，P<0.001）。 结论： （1）在正常的基础状态下，人牙周膜成纤维细胞能可表达OPG和RANKL； （2）rhBMP-2的诱导影响OPG蛋白的表达，推测其可能通过OPG/RANKL通路来影响人牙周膜成纤维细胞参与的破骨样细胞的活化。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一章 rhBMP-2和人牙周膜成纤维细胞对体外诱导破骨样细胞生成的影响

1.1材料和方法

1.2结果

1.3讨论

第二章体外培养的人牙周膜成纤维细胞的OPG和RANKL的表达

2.1材料和方法

2.2结果

2.3讨论

第三章rhBMP-2对人牙周膜成纤维细胞OPG和RANKL表达的影响

3.1材料和方法

3.2结果

3.3讨论

结论

不足之处

参考文献

综述骨形态发生蛋白-2(BMP-2)对成骨和破骨的双向调节作用

攻读学位期间成果

致谢

统计学证明