miR-27a介导二甲双胍抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的机制研究

摘要

目的:
　　近年来，乳腺癌的发病率正以惊人速度上升，已经逐渐成为人类最常见的恶性肿瘤之一。大量的研究证实，糖尿病能够增加乳腺癌的患病风险，且与预后相关，临床上两种疾病常同时存在。二甲双胍作为指南中一线降糖药物，已广泛用于2型糖尿病患者。近年来，大量的流行病学资料显示，二甲双胍可以降低乳腺癌的发病率，并有助于提高乳腺癌患者的预后。microRNAs(miRNAs)是近年来揭示出的一组非编码的小分子单链RNA，长度约为19-25个核苷酸，通过在转录后水平调控其靶基因的表达和/或抑制靶蛋白的翻译来实现其生理作用。研究证实，miRNAs与肿瘤密切相关，在肿瘤发生以及发展过程中扮演着十分关键的角色。研究证实，microRNA27a(miR-27a)有原癌基因活性，在乳腺癌，胃癌，结肠癌，子宫内膜癌等多种肿瘤细胞中呈高表达状态。miR-27a参与乳腺癌细胞凋亡及细胞周期的调控等。近年来，国外学者研究发现，在乳腺癌组织及乳腺癌细胞MCF-7中，AMPKα2因子表达受到广泛抑制，AMPKα2具有肿瘤抑制因子的作用。而至于AMPKα2 mRNA表达下调的机制尚不清楚，因此本研究尝试从microRNA与其靶基因之间的作用关系解释此现象，初步预测AMPKα2可能是miR-27a的下游靶基因，进而从miRNAs水平探讨二甲双胍治疗乳腺癌的新型作用机制。
　　方法:
　　1.以不同浓度(1mmol/L，2mmol/L，5mmol/L，10 mmol/L，20 mmol/L)的二甲双胍分别干预人乳腺癌细胞MCF-7，作用48小时后，用MTT法检测不同浓度组MCF-7细胞的OD值，计算细胞增殖抑制率。
　　2.以20mmol/L的二甲双胍分别干预MCF-7细胞不同的时间(12h，24h，36h，48h，72h)，用MTT法检测不同时间组MCF-7细胞的OD值，计算细胞增殖抑制率。3.将细胞分为对照组和干预组，干预组以20mmol/L的二甲双胍干预MCF-7细胞48小时，用荧光定量PCR方法检测miR-27a及AMPKα2mRNA表达水平，Western Blotting方法检测AMPKα2及凋亡因子caspase-3蛋白表达水平。
　　4.将细胞分为6组：对照组，脂质体lipo2000组（lipo2000组），转染miR-27a mimics组(miR-27amimics组)，转染miR-27a inhibitor组(inhibitor组)及转染其各自阴性对照组(miR-27a N.C组、inhibitor N.C组)。转染后作用48小时，用荧光定量方法检测miR-27a及AMPKα2 mRNA表达水平，Western Blotting方法检测AMPKα2及caspase-3蛋白表达水平。MTT法检测每组细胞的OD值，根据平均值计算细胞增殖抑制率。
　　结果：
　　1.测得不同浓度组的平均OD值表明，随着二甲双胍浓度的增高，各组平均OD值呈下降趋势。单因素方差分析结果显示，不同浓度二甲双胍作用后，各组平均OD值之间相比具有统计学差异(P<0.05)。
　　2.20mmol/L二甲双胍干预MCF-7细胞，随着作用时间的延长，细胞生长明显被抑制。单因素方差分析结果显示，二甲双胍作用36小时，48小时，72小时后，均较作用12小时组出现明显差异(P<0.05)。
　　3.20mmo/L的二甲双胍干预48小时后，荧光定量PCR结果显示miR-27a表达明显下调，而AMPKα2 mRNA表达量较对照组明显增加，有显著性差异(P<0.05)。Western Blotting实验结果显示，AMPKα2蛋白水平在干预组表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，干预组cleaved caspase-3蛋白表达水平较对照组明显增高，有统计学差异(P<0.05)。
　　4.转染miR-27a mimics组，其miR-27a表达显著增高；转染inhibitor组，其miR-27a表达明显受到抑制，而lipo2000组、miR-27a N.C组和inhibitor N.C组均未引起miR-27a表达水平的变化(P>0.05)。
　　5.miR-27amimics组AMPKα2 mRNA表达水平明显下降(P<0.05)，且具有浓度依赖性；inhibitor组AMPKα2 mRNA表达水平则呈浓度依赖性提高(P<0.05)，lipo2000组、miR-27a N.C组和inhibitor N.C组均未引起明显的AMPK mRNA表达水平的变化(P>0.05)。Western Blotting实验结果也证实，miR-27amimics组AMPKα2蛋白水平表达降低，而inhibitor组则表达水平升高，两者的变化都较对照组有统计学差异(P<0.05)。
　　6.Western Blotting实验结果表明，miR-27amimics组caspase-3蛋白水平表达降低，而inhibitor组caspase-3蛋白表达水平升高，且两组之间的变化有统计学差异(P<0.05)。
　　7.MTT结果表明，miR-27a mimics组OD值平均水平明显高于其他五组，细胞增殖抑制率明显下降；而inhibitor组其OD值平均水平最低，细胞增殖抑制率最高，且两组之间的变化有统计学差异(P<0.05)。
　　结论：
　　1.二甲双胍能够抑制MCF-7细胞生长，且呈浓度依赖和时间依赖。
　　2.二甲双胍可能通过下调miR-27a的水平，进而上调AMPKα2表达，进一步激活caspase-3，最终导致MCF-7细胞凋亡。
　　3.AMPKα2可能为miR-27a的下游靶基因。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、二甲双胍对人乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的影响

1.1对象和方法

1.1.1实验材料

1.1.2实验方法

1.1.3统计学方法

1.2结果

1.2.1二甲双胍干预后MCF-7细胞形态学的变化

1.2.2二甲双胍抑制乳腺癌细胞生长具有浓度依赖性

1.2.2二甲双胍抑制乳腺癌细胞生长具有时间依赖性

1.3讨论

1.3.1二甲双胍对MCF-7细胞的增殖抑制作用及意义

1.3.2二甲双胍治疗乳腺癌的可能机制

1.4小结

二、miR-27a及AMPKα2在二甲双胍干预人乳腺癌细胞

2.1对象和方法

2.1.1实验材料

2.1.2实验方法

2.1.3统计学方法

2.2结果

2.2.1二甲双胍可使miR-27a表达降低，AMPKα2在mRNA和蛋白水平表达升高

2.2.2二甲双胍干预激活了caspase-3分解，使裂解的caspase-3表达增多

2.2.3转染效率检测

2.2.4转染miR-27a mimics oligo片段使AMPKα2表达降低；转染miR-27a inhibitor oligo片段使AMPKα2表达上调。

2.2.5转染阴性对照并未引起miR-27a表达变化，也未引起AMPKα2表达的变化

2.2.6各组AMPKα2在蛋白质水平的变化与mRNA变化结果相一致

2.2.7 过表达miR-27a，caspase-3表达减少；沉默miR-27a则caspase-3表达增高

2.2.8 MTT结果显示，过表达miR-27a可以促进MCF-7细胞的生长

2.3讨论

2.3.1 miRNAs与肿瘤

2.3.2 AMPKα2与肿瘤

2.3.3 caspase家族与肿瘤

2.3.4 P53与肿瘤

2.4小结

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: miR-27a研究进展

致谢