碱性成纤维细胞生长因子对人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响

摘要

目的：
　　研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对体外培养的人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，hGFs）成骨分化能力、细胞增殖及凋亡的影响，探索bFGF在人牙龈成纤维细胞体外诱导成骨分化过程中的作用。
　　方法：
　　经患者知情同意后，取就诊于天津医科大学口腔医院颌面外科14-20岁志愿者在下颌无龋病或牙周病的阻生智齿拔除术中分离的新鲜健康牙龈组织，去除表面的血凝块，用含双抗（100 U/L青霉素，100μg/L链霉素）的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）充分冲洗。
　　（1）采用组织块贴壁法体外培养人牙龈成纤维细胞，取第三代细胞进行实验，实验分组如下：组1为普通培养基组；组2为普通培养基+10μg/L bFGF组；组3为成骨诱导组；组4为成骨诱导+10μg/L bFGF组；
　　（2）应用四甲基偶氮唑蓝比色法（methyl thiazolyl terazolium，MTT）检测在不同培养条件下人牙龈成纤维细胞的增殖能力；
　　（3）应用吖啶橙/溴化乙锭（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）双荧光染色法检测在不同培养条件下bFGF对人牙龈成纤维细胞凋亡的影响；
　　（4）应用碱性磷酸酶染色法及茜素红染色法检测在不同培养条件下人牙龈成纤维细胞的成骨分化能力；
　　（5）应用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测人牙龈成纤维细胞在不同培养条件下成骨相关基因：runt相关转录因子（runt-related transcription factor2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、胶原蛋白I（collagen I，Col I）的表达。
　　（6）使用SAS V8统计分析软件对所得数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（x±s）表示。细胞增殖及凋亡结果采用两独立样本t检验，其余结果多组间比较采用方差分析（analysis of variance，ANONA）。检验水准α=0.05，P<0.05时差异有统计学意义。
　　结果：
　　（1）采用组织块贴壁法成功培养出人牙龈成纤维细胞。原代细胞生长相对较缓慢，约5-8天有单个细胞从组织块中爬出，传代后细胞趋于一致的长梭形，生长旺盛；
　　（2） MTT检测显示，在普通培养基和成骨诱导培养基中，10μg/L的bFGF均能促进人牙龈成纤维细胞的增殖（P<0.01）；
　　（3） AO/EB双染色法显示，随着时间的延长各组中凋亡细胞数目增多；在培养第3天至第7天内，不论在普通培养基或者成骨诱导培养基中，10μg/L bFGF均能抑制人牙龈成纤维细胞的凋亡（P<0.05）；而在普通培养基培养的第9天至第11天，以及成骨诱导培养基培养的第11天，10μg/L bFGF表现出对细胞凋亡的促进作用（P<0.05）；
　　（4）在成骨诱导培养基中人牙龈成纤维细胞具有骨向分化能力，碱性磷酸酶染色呈阳性并形成钙结节；10μg/L bFGF对人牙龈成纤维细胞的碱性磷酸酶活性与矿化结节形成能力均无明显影响；
　　（5） PT-PCR结果显示：细胞培养7天时，Runx2在成骨诱导条件下的表达水平高于普通培养基（P<0.05）,加入10μg/L bFGF对Runx2的表达无影响；ALP与Col I在成骨诱导培养基中的表达量明显高于在普通培养基中（P<0.05），10μg/L bFGF的加入仅能促进普通培养基中细胞ALP与Col I的表达水平（P<0.05）。
　　结论：
　　（1）10μg/L bFGF能够促进人牙龈成纤维细胞的增殖，在培养的早期抑制细胞凋亡而晚期时促进细胞凋亡；
　　（2）10μg/L bFGF对人牙龈成纤维细胞的骨向分化无明显影响。

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缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

1对象和方法

1.1主要设备与试剂

1.2人牙龈成纤维细胞的培养

1.3 实验分组

1.4 MTT检测细胞增殖

1.5 AO/EB检测细胞凋亡

1.6 碱性磷酸酯酶染色

1.7 茜素红染色及半定量测定

1.8 RT-PCR检测Runx 2、ALP、Col I和GAPDH表达

1.9 统计分析

2结果

2.1人牙龈成纤维细胞的培养

2.2 bFGF对成骨诱导分化中人牙龈成纤维细胞增殖的影响

2.3 bFGF对成骨诱导分化中人牙龈成纤维细胞凋亡的影响

2.4 bFGF对成骨诱导分化中人牙龈成纤维细胞ALP活性的影响

2.5 bFGF对成骨诱导分化中人牙龈成纤维细胞形成矿化结节能力的影响

2.6 bFGF对成骨诱导分化中人牙龈成纤维细胞表达成骨相关基因能力的影响

3 讨论

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 多聚γ-谷氨酸纤维支架在组织工程中的应用

致谢