丝素/胶原蛋白支架联合雪旺细胞及脂肪干细胞共培养修复大鼠坐骨神经缺损的研究

摘要

目的：
　　组织工程化神经作为自体神经移植的有效替代物，被广泛用于桥接神经缺损及引导神经生长的研究。组织工程化神经和自体神经移植的最大区别在于它们所处的再生微环境不同。如果提供一个理想的再生微环境，组织工程化神经对周围神经的缺损修复还很切实可行的。本研究为了最大程度上地模拟机体再生微环境，我们选择共培养雪旺细胞和脂肪干细胞作为种子细胞，并进一步地将它们引入丝素/胶原蛋白神经支架中，以此来构建组织工程化神经。然后用于修复大鼠坐骨神经10mm缺损，术后12周行电生理学及形态分析学等一系列检查评估神经再生情况。
　　方法：
　　1.分离培养大鼠雪旺细胞（SCs），并行光镜下形态观察及雪旺细胞标记物S-100免疫荧光染色鉴定；分离培养大鼠脂肪干细胞（ADSCs），并取其第3代行流式细胞仪分析，观察其表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105表达情况；取第3代雪旺细胞与脂肪干细胞按2∶1比例进行共培养，每天倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。培养14天后，采用免疫荧光染色检测MAP2、 NeuN和GFAP神经特异标志物表达情况。
　　2.丝素/胶原蛋白神经支架的制备：以桑蚕丝和牛腱为原料制备丝素蛋白和胶原蛋白，将二者按质量比为2∶1比例进行共混，冷冻，真空干燥，制备丝素/胶原蛋白神经复合支架。
　　3.组织工程化神经的构建及性能检测：将共培养的雪旺细胞-脂肪干细胞引入丝素/胶原蛋白神经支架构建组织工程化神经，扫描电镜（SEM）观察支架内部结构及细胞在内部的生长增殖情况；采用 Instron5865力学试验机测其力学性能。
　　4.大鼠坐骨神经缺损模型的建立及不同神经移植物修复神经缺损：单纯丝素/胶原支架移植组(Scaffold组)，组织工程化神经移植组(TENC组)，自体神经移植组(Autograft组)，未手术对照组（Normal组）。
　　5.术后12周行再生神经大体观察、免疫学检测、电生理学检测、形态学计量学分析。
　　结果：
　　1.成功分离及纯化大鼠雪旺细胞，经3次传代后，基本无杂质细胞，纯度较高；采用流式细胞仪分析结果表明第3代脂肪干细胞高表达CD29（91.81％）、CD90（88.22%）、CD73（99.78%）和 CD105（98.32%），低表达CD34（0.20%）和 CD45（0.72%）；雪旺细胞-脂肪干细胞共培养14天后可见原本呈梭形的脂肪干细胞以胞核为中心收缩，胞体折光性增强，胞体伸出多个长而粗的突起，同时雪旺细胞细胞体积增大、周围突起增粗。免疫荧光染色检测 MAP2、NeuN和 GFAP不同程度阳性表达。
　　2.扫描电镜可见组织工程化神经相通性好，在支架三维的孔隙中和表面上有许多神经元样细胞生长且伸出长的突起黏附于支架，细胞生长状况良好。支架最大和平均弹性模量分别为10.8±0.3 MPa，8.14±0.2 MPa。该弹性模量的大小完全可以抵抗移植后肌肉所产生的张力。
　　3.各组实验动物都不同程度上实现缺损神经的再生修复。但从实验动物神经修复效果来讲，组织工程化神经移植组和自体神经移植组都较为相似，都优于单纯丝素/胶原蛋白支架移植组。
　　结论：
　　1.雪旺细胞与脂肪干细胞共培养，两者不仅能够共生，而且雪旺细胞能显著促进脂肪干细胞向神经元样细胞分化。
　　2.丝素、胶原作为两种优异的天然可降解材料，以合适的配比混合，集足够的力学性能、良好的生物相容性及适宜的降解性于一体，为组织工程化神经提供理想的载体。
　　3.丝素/胶原蛋白神经支架联合雪旺细胞-脂肪干细胞共培养所构建的组织工程化神经具有初步正常神经样结构，并对坐骨神经缺损的修复具有良好的桥接和促神经生长作用。

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缩略语/符号说明

前言

材料与方法

1.1材料

1.2大鼠SCs的分离培养纯化及鉴定

1.3大鼠ADSCs的分离培养及鉴定

1.4 SCs-ADSCs共培养系统的建立、观察及鉴定

1.5 丝素/胶原蛋白神经支架的制备

1.6 组织工程化神经的构建及其性能检测

1.7 动物实验分组及造模

1.8 实验动物术后神经电生理及形态学分析

1.9 统计学分析

结果

2.1大鼠SCs的培养及鉴定

2.2大鼠 ADSCs培养与鉴定

2.3 SCs-ADSCs共培养观察及鉴定

2.4组织工程化神经的构建及其性能检测

2.5实验动物术后神经电生理及形态学分析

讨论

3.1种子细胞的来源、分离及其共培养

3.2支架材料的选择及其性能

3.3实验动物神经再生效果

3.4新型组织工程化神经的构建及其意义

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述: 周围神经损伤修复技术及其再生机制研究进展

致谢

个人简历