gAcrp30/AMPKα2在HIIT激活骨骼肌细胞自噬中的机制研究

摘要

研究目的：
　　随着全民健康理念日益普及，一种新兴运动模式—高强度间歇运动(High intensity interval training, HIIT)以其耗时短、强度大、恢复快的特点，受到运动员和运动健身爱好者的青睐。HIIT通过快速提高心率、增加身体氧耗，同时制造缺氧状态，使机体在恢复期仍需要更多的氧气，进而消耗额外的热量。也正因如此，针对HIIT的研究多集中在呼吸循环系统相关临床表现上，而对内分泌代谢相关信号分子通路的研究较少。然而，由于HIIT显著的减脂效应使得人们开始揣测，在其降低脂肪组织体积的情况下，对诸如Acrp30等有益的脂肪因子的影响如何。大多数研究显示，HIIT显著减脂的同时，能够增加Acrp30的表达，但也有部分研究结果与其相反，差异可能与HIIT运动方案、受试个体基础健康状况以及所检测Acrp30的形式有关。
　　细胞自噬是目前生物医学范畴内的研究热点之一，广泛参与机体的各种病理生理过程。已有研究显示gAcrp30能够对骨骼肌细胞自噬产生影响，并于多种细胞系中发现AMPK(AMP activated protein kinase)在细胞自噬诱导过程中发挥的重要作用，自噬是为机体快速提供燃料的生理途径，在HIIT造成的细胞能量迅速消耗状态下，骨骼肌细胞自噬应对“饥饿”的响应如何，目前的研究结果仍很局限。不仅如此，在HIIT影响骨骼肌细胞自噬过程中，AMPKα2是否也在其中发挥重要作用，仍有待进一步探究。
　　针对目前的研究现状，为保证受试个体基础状况基本相同，选取健康雄性C57BL/6小鼠为研究对象，同时严格按照HIIT的运动概念设计方案，即最大摄氧量(VO2max)达85%以上，设置安静和中等强度持续运动(Moderate intensity continuous training, MICT)为对照组，针对Acrp30作用于骨骼肌细胞表面受体的主要活性形式——球形脂联素(Globular adiponectin, gAcrp30)进行检测，以单纯研究HIIT对血清gAcrp30的影响。除此之外，本研究对gAcrp30作用于骨骼肌细胞表面特异性受体后的下游机制进行了探讨，基于其对细胞自噬水平产生影响的相关研究结果，尝试探讨AMPKα2在其中的重要作用，并利用AMPKα2基因敲除小鼠进行在体实验验证，以期为探讨HIIT良好健康效应背后的机制提供依据。
　　研究方法:
　　(1)动物模型:4周龄C57BL/6雄性小鼠36只，其中包括AMPKα2+/+(n=12)， AMPKα2+/-(n=12)，AMPKα2-/-(n=12)，随机分为安静对照组(Control)、中等强度持续运动组(MICT)和高强度间歇运动组(HIIT)。运动干预结束后行体成分分析，随后处死取材；
　　(2)运动方案:干预时间为6周、MICT组运动形式为75%VO2max强度的持续跑台运动，1小时/次，1次/天，5次/周；HIIT为85%VO2max强度与50%VO2max强度的运动交替进行12个循环，50分钟/次，1次/天，5次/周；
　　(3)饮食配方：华阜康公司1022配合维持饲料喂养6周；
　　(4)体成分分析：运动干预结束后应用“ImpediVET实验动物体组成测定分析仪”输出体质指数，总体液量，体脂含量等指标，随后进行统计分析；
　　(5)血清gAcrp30检测：小鼠处死前行内眦取血，静置离心取上清，应用酶联免疫吸附法对血清gAcrp30水平进行检测；
　　(6)细胞培养：应用gAcrp30和DN-AMPKα2(K45R)处理C2C12肌管细胞，提取细胞蛋白；
　　(7) Western blot检测骨骼肌组织/细胞AMPKα2, pAMPK-Thr172, pACC-Ser79, LC3II/I, Beclin1及p62蛋白表达水平。
　　研究结果：
　　(1)三组小鼠体成分分析结果：与Control组同基因型小鼠相比，a.体重：运动开始前各组小鼠体重无显著差异，运动结束后，MICT组和HIIT组小鼠体重显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；b. BMI:MICT组各基因型小鼠的BMI有所下降，但未见明显的统计学差异(P＞0.05)，HIIT组中，AMPKα2+/+和AMPKα2+/-小鼠的BMI水平下降显著(P<0.01或P<0.05)，而AMPKα2-/-与Control组相比BMI水平下降不明显(P＞0.05)；c.总体液量：三组小鼠总体液量未见明显差异(P＞0.05)；d.体脂含量：MICT组各基因型小鼠的体脂含量均呈下降趋势，但仅AMPKα2+/+的下降有统计学意义(P＞0.05)；而HIIT组小鼠中，AMPKα2+/+和AMPKα2+/-小鼠体脂含量下降明显(P<0.01或P<0.05)，AMPKα2-/-小鼠体脂含量的下降无统计学意义(P＞0.05)；
　　(2)血清gAcrp30水平：与Control组同基因型小鼠相比，MICT组各基因型小鼠血清gAcrp30水平轻微升高，而HIIT组小鼠gAcrp30明显上升(P<0.01)；(3) gAcrp30处理C2C12肌管细胞：浓度梯度(0,0.1,0.25,0.5,0.75,1μg/ml)和时间梯度(0,3,8,16,24h)处理结果显示，gAcrp30能够显著增加C2C12肌管细胞自噬水平，且具有一定的浓度和时间依赖性，在浓度1μg/ml或时间干预24h时gAcrp30的作用效果最为显著;
　　(4) Western-blot检测：gAcrp30干预C2C12肌管细胞(1μg/ml,24h)，发现gAcrp30显著增加了pAMPK-Thr172和自噬相关蛋白LC3II/I和Beclin1的表达同时降低了p62的表达(P<0.01或P<0.05)；而经DN-AMPKα2(K45R)处理后， gAcrp30的这一诱导效应被削弱；HIIT干预后的AMPK+/+和AMPK+/-小鼠骨骼肌组织 pAMPK-Thr172, LC3II/I, Beclin1表达上调而 p62表达下降(P<0.01或P<0.05)，而在AMPK-/-小鼠中这一效应并不显著。
　　研究结论：
　　(1)与安静对照组相比，6周MICT和HIIT均降低了小鼠的体重、体脂含量和BMI，但HIIT干预下的各指标下降更为明显，不仅如此，AMPKα2在其中发挥重要作用；
　　(2)与安静对照组相比，6周HIIT干预显著增加了小鼠血清gAcrp30水平，而MICT增加gAcrp30水平的效果不显著；
　　(3)离体实验中，gAcrp30以非AMPKα2依赖性机制增加了C2C12肌管细胞自噬活性；
　　(4)与安静对照组相比，6周HIIT增加了骨骼肌细胞自噬活性，且这一激活作用依赖于AMPKα2。

目录

声明

缩略语

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1. 研究对象

2. 实验材料

3. 实验方法

4. 统计学处理

结果

1. 小鼠代谢表型的检测

2. 高强度间歇运动对小鼠生长发育及体成分影响的分子机制

讨论

1. 高强间歇运动在控制体重和体质指数，改善体成分方面的效应优于中等强度持续运动

2. AMPKα2在高强间歇运动控制体重和BMI、改善体成分方面发挥重要作用

3. 高强间歇运动显著增加了小鼠血清球形脂联素水平

4. 小鼠血清球形脂联素含量与体重及体脂含量呈显著负相关

5. AMPKα2在高强间歇运动诱导骨骼肌细胞柠檬酸合酶活性增强过程中发挥重要作用

6. 重组小鼠球形脂联素增加C2C12肌管细胞自噬活性

7. 球形脂联素以非AMPKα2依赖性途径激活C2C12肌管细胞自噬

8. AMPKα2在高强度间歇运动影响骨骼肌细胞自噬中发挥重要作用

结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:不同运动形式对脂联素影响的研究进展

致谢

个人简历