HSP90抑制剂AUY922逆转氟维司群在乳腺癌细胞中的反馈性激活效应

摘要

研究背景及目的：
　　内分泌治疗作为乳腺癌辅助治疗重要的治疗策略，能够明显改善激素受体阳性乳腺癌患者的预后[1]，氟维司群（Fulvestrant）是常用的内分泌药物[2]。蛋白组学分析发现，长期雌激素剥夺细胞(long-term estrogen deprivation cells,LTED cells)的ErbB家族膜受体介导的PI3K/mTOR信号通路活性增强。证据表明，在雌激素治疗耐药的乳腺癌患者中存在PI3K/AKT信号通路的激活[3-7]，从而在细胞的生长增殖中发挥重要作用。然而，从目前的研究结果来看，在雌激素耐药的细胞中，单独应用EGFR抑制剂吉非替尼并不能抑制AKT的反馈性激活[8]。
　　目前的信号调控网络相关研究表明肿瘤细胞生长增殖及耐药等过程十分复杂，单纯的干扰或者抑制某一特定的靶点对于抑制细胞增殖杀灭癌细胞的作用可能十分有限。因此，如果能够同时抑制肿瘤细胞中生长相关的多个关键蛋白对于抑制杀灭肿瘤似乎更为有效。
　　HSP90是细胞内广谱表达的伴侣蛋白，许多肿瘤细胞恶性表型的相关蛋白都依赖于HSP90的折叠功能从而发挥其生物学效应。临床相关资料表明，肿瘤组织中HSP90的表达相比较于癌旁正常组织要高2-3倍，而且与临床不良预后明显相关[9,10]。研究发现，HSP90伴侣蛋白的高表达与乳腺癌的不良预后具有密切相关，且是影响乳腺癌预后的独立因素。HSP90的高表达与HER2阳性、ER阳性、肿瘤较大、组织学分级较高以及淋巴结转移具有明显相关性[11]。研究表明，HSP90能够增强乳腺癌细胞对于激素治疗的抵抗性，与激素治疗的耐药性相关[12]。
　　AUY922是第二代HSP90抑制剂，它可以竞争性结合于HSP90的ATP结合位点，从而抑制HSP90的生物学活性，导致细胞内很多关键蛋白不能被正常折叠从而失去生物学功能。
　　由于氟维司群的反馈性激活效应是乳腺癌细胞发生耐药的重要原因，而且多个通路及多种通路相关蛋白参与了这一过程，然而，目前仍然没有关于AUY922是否能够逆转这一反馈性激活效应的相关研究。我们推测，AUY922可能能够通过抑制HSP90的活性，从而抑制ErbB家族及PI3K/AKT及ERK信号通路，逆转氟维司群带来的反馈性激活效应，为联合用药相关临床试验提供新的基础理论支持。
　　研究方法：
　　1.利用western blotting技术检测了氟维司群单药作用对于MCF-7和T47D细胞的ER水平的影响，以及短时间内对于ErbB家族蛋白的反馈性激活，进而进一步活化下游的PI3K/AKT和ERK信号通路。并且利用RT-PCR检测了ErbB家族的mRNA水平在氟维司群处理后的变化。
　　2.利用western blotting技术检测了AUY922单药对于PI3K/AKT和ERK信号通路的抑制作用。
　　3.Western blotting技术检测在氟维司群处理的基础上联合AUY922能够成功抑制并逆转氟维司群带来的ErbB家族蛋白反馈性激活效应，进而抑制下游增殖相关PI3K/AKT和ERK信号通路。
　　4.利用MTT实验、平板克隆实验检测双药联合对于细胞生长的抑制作用，利用流式细胞技术检测双药联合作用对于细胞周期的阻滞。
　　5.人源肿瘤组织的离体验证实验中用western blotting技术进一步证实了AUY922对于氟维司群的反馈激活效应的逆转作用。
　　研究结果：
　　1.氟维司群能够在48小时内降低MCF-7和T47D细胞中的ER的水平。
　　2.氟维司群在降低MCF-7和T47D细胞ER水平的同时能反馈性激活ErbB家族蛋白，同时p-EGFR、p-HER2、p-HER3及p-HER4的表达量增加，表明其功能活化。这一反馈性激活作用在氟维司群作用的短时间（48小时）内引起的。
　　3.AUY922单药能够有效抑制MCF-7和T47D中的HSP90活性，进一步检测发现氟维司群对于HSP90活性并无影响。AUY922能够有效抑制PI3K/AKT和ERK信号通路的活性。
　　4.在氟维司群作用24小时之后的基础上，进一步联合AUY922能够成功抑制并逆转氟维司群引起的ErbB家族蛋白的反馈性激活效应，并且有效抑制了下游增殖相关PI3K/AKT和ERK信号通路的活性。
　　5.在细胞功能学实验中，双药联合能够有效抑制细胞生长，在平板克隆形成实验中发现，双药联合能够更加有效抑制细胞克隆形成。细胞周期检测中发现，在ER+乳腺癌细胞中双药联合能够更有效的阻滞细胞周期。
　　6.人源肿瘤组织的体外验证实验证明，氟维司群的治疗确实能够反馈性激活ErbB家族蛋白，引起下游PI3K/AKT和ERK信号通路的活化，联合应用AUY922能够成功逆转这种反馈性激活效应。进一步证实了细胞系中的实验结论。
　　研究结论：
　　本研究发现并证实了ErbB受体家族及其下游增殖相关通路PI3K/AKT和ERK信号通路在氟维司群治疗后能够发生反馈性激活，而HSP90抑制剂AUY922能够多靶点抑制这些反馈性活化的蛋白活性，同时，这一实验结果在乳腺癌细胞系及新鲜乳腺癌离体标本中均得到了证实。

目录

声明

缩略语/符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

对象和方法

1.1实验材料

1.2主要实验方法

1.3统计学方法

实验结果

2.1氟维司群能够降解MCF-7和T47D细胞中的雌激素受体ER

2.2氟维司群能够反馈性激活ErbB受体家族蛋白

2.3氟维司群能够引起ErbB受体下游的PI3K/AKT和ERK通路的激活

2.4 AUY922能够抑制MCF-7和T47D细胞中HSP90蛋白的活性

2.5氟维司群药物作用并不影响MCF-7和T47D细胞中HSP90蛋白活性

2.6 AUY922能够抑制MCF-7和T47D细胞中PI3K/AKT及ERK通路活性

2.7 联合应用AUY922能够逆转氟维司群引起的反馈性激活的ErbB受体家族蛋白

2.8 联合应用 AUY922 能够抑制氟维司群作用后反馈性激活的PI3K/AKT和ERK信号通路

2.9 联合应用AUY922与氟维司群抑制细胞增殖

2.10 AUY922与氟维司群的联合应用能够更加有效抑制细胞周期

2.11 AUY922与氟维司群两药联合作用机制的乳腺癌标本验证实验

讨论

3.1内分泌治疗在乳腺癌中的重要性及耐药情况

3.2内分泌治疗的耐药机制

3.3 HSP90及抑制剂

3.4联合应用氟维司群和AUY922的作用结果

3.5人体肿瘤组织的体外验证实验的重要性

3.6小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述:内分泌耐药在乳腺癌中的研究进展

致谢

个人简历