酶敏感的肿瘤靶向siRNA递释系统研究

摘要

目的： RNA干扰技术（RNAi）通过调节目的基因的表达来发挥治疗效果，为癌症治疗提供了新的方法。但siRNA的物理化学特性使其不易透过细胞膜而难以发挥药效。为此研究人员开发了许多siRNA的递送体系以期改善其治疗效果。但多数递送体系尚存在着转染效率低，脱靶效应等问题。本研究构建了双重酶敏感型抗体靶向的siRNA递释体系（siRNA-LMWP-Linker-Antibody），以期利用穿膜肽的促渗透作用进行siRNA的跨膜运输，同时借助特异性抗体和肿瘤酶实现siRNA的高效靶向递送及定点释放，最终改善siRNA的治疗效果。 内容： 本研究以结肠癌为模型，以肿瘤表面特异性表达的抗原和内肽酶为双重靶标，构建具有“前药”特性的siRNA递释系统siRNA-LMWP-Linker-Antibody。体系将穿膜肽（LMWP）与siRNA共价偶联构建前体药物，并以此来促进药物的入胞及胞浆释放。随后利用癌细胞表面特异性过表达的Legumain酶的底物肽（Linker）连接该前体药物与抗体构建靶向递药体系。当体系在抗体介导作用下靶向至结肠癌细胞后，癌细胞表面的Legumain酶作为激活因子切断其底物肽Linker，释放出前药siRNA-LMWP，激活穿膜肽的细胞渗透性能，促进siRNA入胞，从而提高其对靶细胞的基因沉默效率。 方法： 首先开发了新型的前体药物siRNA-S-S-PEG-LMWP，该方法有效解决了体系聚集、沉淀问题，进一步将前体药物通过酶特异性底物肽与抗体共价偶联，构建了siRNA-LMWP-Linker-Antibody递释体系。分别对合成的前体药物和双重酶敏感的肿瘤靶向siRNA递释体系进行了表征，验证了所构建递释体系抗体靶向性，肿瘤酶响应性及基因沉默效率等关键科学问题。 1.使用异双官能团聚乙二醇衍生物将细胞穿膜肽与siRNA通过二硫键一对一共价键连，制备得到前体药物siRNA-S-S-PEG-LMWP。通过考察三种不同的合成纯化方法优化出了高产率的最佳方案。通过质谱、凝胶电泳、粒径和ζ电位等手段对前体药物进行了表征。考察了前体药物siRNA-S-S-PEG-LMWP的细胞摄取能力。 2.将穿膜肽与特异性肿瘤酶的底物短肽制成融合肽，并与巯基化的siRNA共价键连得到前体药物。随后将前体药物上的羧基用EDC/NHS进行活化与抗体上的氨基反应形成Legumain酶敏感型抗体靶向递释体系siRNA-LMWP-AANL--Antibody。通过凝胶电泳对其进行表征。 3.考察了递释体系的血清稳定性。研究了HCT116，SW620，HT1080三种细胞中递释体系的抗体结合特异性、及酶响应性。用激光共聚焦扫描显微镜及Western Blot实验考察了所构建释药体系的基因沉默效果。 4.体外MTT实验考察了递释体系的安全性。构建MMP-2酶敏感型递释体系的酶响应性实验考察所构建系统的普适性。 结果： 1.通过对三种合成纯化方法的比较，以NHS-PEG-OPSS为交联剂合成的前体药物siRNA-S-S-PEG-LMWP产率最高，可达48%。通过MALDI-TOF对siRNA-S-S-PEG-LMWP的分子量检测以及琼脂糖凝胶电泳证实前体药物成功合成，且粒径为2.49±0.17nm，均一稳定。此外，该前体药物可以被细胞有效摄取，实现siRNA药物的跨膜递送。 2.琼脂糖凝胶电泳验证Legumain酶敏感型抗体靶向递释体系siRNA--LMWP-AANL-Antibody构建成功。 3.实验结果表明所构建递释体系在不影响抗体靶向性能的前提下，保护siRNA在血清中稳定不降解，且具有良好的肿瘤酶响应性，在抗体与细胞表面抗原特异性结合后，底物肽被酶切，激活前体药物，促进siRNA了入胞，产生了良好的基因沉默效果。 4.细胞毒性结果证实递释体系安全性较好，MMP-2酶敏感型递释体系产生良好的酶响应性，表明构建的递释体系具有一定的普适性。 结论： 本课题成功构建了酶敏感型抗体靶向递释体系，为siRNA等核酸类大分子药物的靶向递送搭建了一个平台。同时研究中多项技术具有普适性，可推广到其他药物传递系统，也为近一步的临床转化提供了理论支持和技术参考。

目录

第一个书签之前