低密度脂蛋白偶联N-琥珀酰壳聚糖纳米粒共转运siRNA/阿霉素肿瘤靶向递药系统

摘要

目的：从血浆中分离低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL),与胆固醇修饰的多药耐药(multidrug resistance,MDR)小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)形成siRNA/LDL复合物。合成中性条件下即有较好溶解度的N-琥珀酰壳聚糖(N-succinyl chitosan,SCS),并以之为载体,以阿霉素(doxorubicin,Dox)为模型药物,制备 siRNA/LDL偶联的阿霉素 N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(Dox-siRNA/LDL-SCS-NPs),利用 LDL的内源性优势和靶向作用,实现siRNA和抗癌药物的有效共转运,增加抗肿瘤疗效。
　　方法：(1)采用溴化钾密度梯度离心法从人血浆中分离LDL,对其粒径分布和形态进行考察,并验证LDL的体外靶向性。(2)合成N-琥珀酰壳聚糖,通过红外光谱、1H-NMR表征其结构。以其为载体,采用交联法制备阿霉素 N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(Dox-SCS-NPs),通过单因素考察和正交设计优化纳米粒的制备工艺,再通过缩合反应制备 LDL偶联的Dox-SCS-NPs(Dox-LDL-SCS-NPs)。利用红外光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳对纳米粒进行表征,并考察其在不同介质中的释放特性。(3)将胆固醇修饰的siRNA与LDL孵育制备siRNA/LDL复合物,并考察该复合物的血清稳定性和对siRNA的酶保护作用。制备共转运纳米粒Dox-siRNA/LDL-SCS-NPs,考察纳米粒的细胞毒性,通过不同抑制剂研究纳米粒的细胞摄取机制,对纳米粒中siRNA的转染效果和mRNA水平逆转耐药性进行研究。(4)体外溶血试验评价共转运纳米粒的安全性;考察Dox及其纳米粒在巨噬细胞中的摄取以评价纳米粒逃避巨噬细胞吞噬的能力。(5)建立皮下瘤和肝原位瘤模型,以Cy7标记纳米粒,利用小动物活体成像技术考察纳米粒的体内分布。
　　结果：(1)分离得到的LDL平均粒径为(23.4±0.58)nm,形态圆整,其摄取由LDL受体介导。(2)合成了SCS,其结构得到红外光谱和1H-NMR的验证。通过单因素试验和正交设计优化法制备的Dox-LDL-SCS-NPs平均粒径(206.4±9.2)nm,PDI为0.215,包封率(71.06±1.42)％,载药量(12.35±0.87)％。透射电镜、红外光谱和电泳结果均表明LDL已成功偶联至纳米粒,而不是简单的物理混合。纳米粒中阿霉素的释放具有缓释性,且在酸性条件下释放更为迅速。(3)优化的siRNA/LDL复合摩尔比为30:1,LDL对siRNA的酶降解具有保护作用。与原料药和未修饰纳米粒相比,LDL偶联的纳米粒对HepG2和HepG2/ADM的细胞毒性更强,而对正常肝细胞L-02的毒性较弱。纳米粒可能通过网格蛋白和细胞质膜微囊介导的内吞途径进入细胞,其中还可能有SR-B族受体的参与。脂筏结构的完整性对LDL偶联纳米粒的摄取也具有显著影响。体外转染和RT-PCR结果显示,共转运纳米粒能有效转染进入细胞并在mRNA水平抑制耐药基因的表达。(4)共转运纳米粒的巨噬细胞摄取量低于原料药、未修饰纳米粒以及游离siRNA,siRNA制备成纳米粒后可以有效地减少巨噬细胞吞噬。(5)小动物活体成像实验显示纳米粒对皮下瘤和肝原位瘤具有良好的靶向性。
　　结论：优化的纳米粒制备工艺简单易行,方法稳定。LDL偶联的纳米粒对肿瘤细胞更具亲和力,能有效转染siRNA抑制耐药基因的表达,对siRNA逃避巨噬细胞吞噬具有保护作用,同时在体内可发挥LDL和纳米粒自身的双重靶向作用。研究结果表明,LDL偶联的多聚体纳米粒有望成为一种有效的共转运基因和化疗药物的肿瘤靶向递药系统。

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引言

第一章 人血浆低密度脂蛋白的分离鉴定

材料

方法与结果

讨论与小结

第二章 LDL偶联N-琥珀酰壳聚糖纳米粒的制备与表征

材料

方法与结果

讨论与小结

第三章 LDL偶联纳米粒共转运siRNA和阿霉素逆转肿瘤耐药性研究

材料

方法与结果

讨论与小结

第四章 共转运纳米粒体外安全性和巨噬细胞吞噬考察

材料

方法和结果

讨论和小结

第五章 共转运纳米粒的体内靶向性考察

材料

方法和结果

讨论和小结

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表的论文及其它

英文缩略词表

致谢