应用双功能嵌合肽修饰钛种植体表面抑制生物膜形成的研究

摘要

目的： 口腔种植体表面形成的细菌生物膜（biofilm）易引起种植体周围疾病的发生，最终可导致种植体脱落、种植失败。种植体表面初期附着链球菌是生物膜形成的基础，因此抑制种植体表面链球菌的初期粘附及干扰后续生物膜形成，有利于种植初期骨结合的形成，实现种植体初期稳定性。人类β-防御素-3（human beta-defensin3，hBD-3）是一种人体产生的阳离子抗菌肽，具有广谱的抗菌性能。特异性钛结合肽：RKLPDAGPMHTW（Ti-binding peptide-1，TBP-1）可特异性识别钛并与其表面稳定结合。本研究将源于hBD-3的3个片段通过3个甘氨酸（G）连接链与TBP-1合成3段嵌合肽（TBP-1-GGG-hBD3-1、TBP-1-GGG-hBD3-2、TBP-1-GGG-hBD3-3），既能吸附在钛片表面又能有效地发挥抗菌作用，且不易产生耐药性，实现步骤简单过程环保的种植体表面改性。应用双功能嵌合肽修饰钛片表面，并对改性后的表面进行性质表征以及对体外细胞学和细菌学等效应进行评价，以期获得提高种植体成功率的改良种植体。 方法： 1.嵌合肽的基本性质和抗菌性能的检测：通过PSIPRED软件和Peptide Calculator软件对嵌合肽的基本性质和结构进行预测；用圆二色光谱（CD）和拉曼光谱检测嵌合肽的二级结构；通过细菌最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）实验及生物膜易感性实验，检测嵌合肽对初期附着菌口链球菌(Streptococcus oralis，S.oralis)、血链球菌(Streptococcus sanguinis，S.sanguinis)、格登链球菌(Streptococcus gordonii，S.gordonii)的抑菌作用。 2.嵌合肽修饰钛片表面抗菌性能检测及机制的探究：用X射线光电子能谱（XPS）分析嵌合肽修饰钛片样本表面的元素组成，评价嵌合肽吸附在钛片表面的情况；用激光共聚焦电子显微镜（CLSM）、抗菌效率实验（R）、扫描电子显微镜（SEM）检测嵌合肽修饰钛片表面对初期附着菌S.oralis、S.sanguinis或S.gordonii的抑菌作用；用透射电子显微镜（TEM）观察细菌形态的变化，以及应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验探究嵌合肽的潜在抗菌机理。 3.嵌合肽修饰钛片样本表面生物相容性评价：将MC3T3-E1细胞接种在嵌合肽修饰的钛片样本表面培养1d、3d、5d、7d后，用CCK-8和AO/EB荧光染色检测细胞增殖情况，评价嵌合肽的生物相容性。 结果： 1.嵌合肽抗菌性能研究：软件预测、CD光谱和拉曼光谱结果显示，TBP-1-GGG-hBD3-1、TBP-1-GGG-hBD3-2、TBP-1-GGG-hBD3-3都带有正电荷，均有与抗菌性能相关的二级结构（α螺旋、β折叠）和两亲性，其中TBP-1-GGG-hBD3-3有更多的亲水基团和带有更高的正电荷（+8.9）；MIC、MBC和生物膜易感性实验结果显示，TBP-1-GGG-hBD3-1、TBP-1-GGG-hBD3-2、TBP-1-GGG-hBD3-3对链球菌的生长均具有抗菌作用，其中，TBP-1-GGG-hBD3-3对浮游态和生物膜态的S.oralis,S.gordonii,S.sanguinis均有最强的抑菌性。 2.嵌合肽修饰钛片表面抗菌性能研究：XPS结果显示，TBP-1-GGG-hBD3-1、TBP-1-GGG-hBD3-2、TBP-1-GGG-hBD3-3都能吸附在钛片表面上；CLSM、抗菌效率(R)实验结果显示，TBP-1-GGG-hBD3-3在血清或唾液存在的情况下，仍然能够稳定修饰在钛片表面发挥抗菌作用；SEM结果显示，细菌生物膜量减少和细菌形态发生改变；TEM结果显示，TBP-1-GGG-hBD3-3破坏了质膜，形成孔样通道，可见细胞内含物溢出，表明嵌合肽可能通过作用于细胞膜而起到抗菌作用；qRT-PCR结果表明，TBP-1-GGG-hBD3-3能够通过抑制sspA和sspB基因的表达从而影响S.gordonii在钛片样本表面的黏附。 3.嵌合肽修饰钛片表面生物相容性研究：CCK-8和CLSM实验结果显示，MC3T3-E1细胞在嵌合肽修饰的钛片样本表面上增殖状态与对照组相比，无明显差别，表明TBP-1-GGG-hBD3-3具有良好的生物相容性。 结论： 本研究表明，TBP-1-GGG-hBD3-1、TBP-1-GGG-hBD3-2和TBP-1-GGG-hBD3-3均具有双功能的特性，既能够特异性吸附在钛片表面又能发挥抗菌活性，且生物相容性好。因此，应用该嵌合肽对钛种植体表面进行改性，能够抑制初期附着链球菌的生长及生物膜的形成，为减少种植体周围炎的发生，从而提高种植体的成功率提供可能。

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