凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体在抑制单增李斯特菌及其生物被膜中的应用

摘要

本发明公开了凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体在抑制单增李斯特菌及其生物被膜中的应用，属于食品微生物控制技术领域。本发明根据植物凝集素与被膜胞外多糖基质中糖单元的特异性亲和力，制备凝集素修饰的鳀鱼抗菌肽脂质体，建立单增李斯特菌生物被膜模型，通过杀菌曲线、菌落计数和结晶紫染色评价凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌及其生物被膜的抑制作用。结果表明凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌有杀菌作用，能干预其生物被膜的形成，并能清除已形成的生物被膜，且上述作用均呈浓度依赖型关系。因此，凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体可用于抑制或清除食品加工贮藏环境中的单增李斯特菌及其生物被膜。

说明书

技术领域

本发明属于食品微生物控制技术领域，涉及凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体在抑制单增李斯特菌及其生物被膜中的应用。

背景技术

单增李斯特菌是世界卫生组织定义的四大食源性致病菌之一。该菌能通过污染的食物进入人畜体内，引发败血症、脑膜炎、流产和单核细胞增多等症状，致死率达20～30%。美国、法国、加拿大等国多次出现该菌引发的食物污染导致的临床疾病问题。单增李斯特菌可黏附在食品或食品加工设备表面，形成生物被膜。生物被膜是与浮游细胞相对应的一种微生物细胞在生物或非生物表面的生长方式，是细胞分泌的多糖、纤维蛋白和脂质蛋白等具有保护性和吸附性的多聚基质将其自身包裹而形成的结构性微生物群落。已形成的生物被膜还是其它多种致病菌及腐败微生物的藏身之处，菌落间的互感效应引发各微生物的协同共生，增加食品本身和加工环境的污染或再污染风险。被膜态与浮游态单增李斯特菌在细胞结构和生物学特性上的差异，导致前者比后者抗性更强、危害更严重、且更难清除。

国内外学者在单增李斯特菌及其生物被膜的控制方法上进行了相关探索。然而，这些方法主要采用化学消毒剂、天然精油、抗菌肽、噬菌体和物理方法。这些方法能否应用于食品领域需要考虑其安全性、有效性和经济性。致病菌易对化学消毒剂产生耐药性，且化学品的潜在毒性及其残留会降低食品安全性。精油类较强的天然风味可能会干扰食品本身的感官性状，且其疏水特性会阻碍其从生物被膜表面向内部的扩散。噬菌体在食品中应用的安全性仍需评价，且大剂量使用成本较高并可能会导致抗噬菌体菌株的出现。一些物理手段如超声波、高压脉冲电场等，成本较高且有一定的局限性。因此，有必要开发新型、安全、高效、具有潜在食品行业应用价值的的控制/清除单增李斯特菌及其生物被膜的方法。

抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子短肽。抗菌肽具有不同于传统抗生素的杀菌机制，不易产生病原菌耐药性和交叉抗性。少部分抗菌肽已被证实具有抑制单增李斯特菌及其生物被膜的作用，如Peptide1037(de la Fuente-Núñez C, Korolik V, Bains M, et al. Inhibition of bacterial biofilm formation and swarming motility by a small synthetic cationic peptide[J]. Antimicrob Agents Ch, 2012, 56(5): 2696-2704.)。脂质体包埋型抗菌肽具有靶向性、控释性、细胞亲和性和组织相容性的特点。生物被膜含有大量胞外多糖基质，基于凝集素的特异性糖结合效应，在药物脂质体上连接凝集素，可实现脂质体靶向性作用于口腔细菌生物被膜的目标(Jones M N, Francis S E, Hutchinson F J, et al. Targeting and delivery of bactericide to adsorbed oral bacteria by use of proteoliposomes[J]. BBA-Biomembranes, 1993, 1147(2): 251-261.)。然而，现有技术中，未见采用食品源尤其是鳀鱼源抗菌肽作为被包埋物，构建凝集素表面修饰型抗菌肽脂质体，抑制或清除单增李斯特菌生物被膜的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为解决食品加工贮藏领域单增李斯特菌及其生物被膜引起的食品污染问题，而提供一种凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体在抑制单增李斯特菌及其生物被膜中的用途。

为实现上述目的，本发明以鳀鱼抗菌肽（GLARCLAGTL）为被包埋物，制备凝集素修饰的鳀鱼抗菌肽脂质体，考察其对浮游态单增李斯特菌的抑制效果，建立单增李斯特菌体外生物被膜模型，通过结晶紫染色法评价凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌生物被膜的抑制作用。

本发明发现，0.5MIC、1MIC、2MIC和3MIC四种不同浓度的凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌均有杀菌作用，且杀菌效果随着抗菌肽浓度的增加而提高。在培养初始阶段，加入上述四种浓度的凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体，对单增李斯特菌生物被膜的形成具有显著抑制作用。生物被膜形成量随着抗菌肽脂质体浓度的增大而减小。不同浓度的凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对已形成的单增李斯特菌生物被膜具有显著清除作用。其清除效果随着抗菌肽脂质体浓度的增加、清除时间的延长而增加。

综上所述，凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体具有抑制和清除单增李斯特菌及其生物被膜的作用。

以上所述的凝集素为植物凝集素的一种；优选为麦胚凝集素和伴刀豆凝集素。

以上所述的鳀鱼抗菌肽的氨基酸组成为GLARCLAGTL (Gly-Leu-Ala-Arg-Cys-Leu-Ala-Gly-Thr-Leu)，其分子量为973.11 Da。

与现有技术相比，本发明方法的优势体现在：

1.本发明中所用抗菌肽和凝集素均为食品来源，可安全、有效的应用于食品领域；

2.本发明中凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌及其生物被膜具有显著抑制作用；

3. 本发明以凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体为核心技术，利用凝集素和生物被膜胞外多聚物基质中的糖类物质的特异性亲和作用，结合抗菌肽不易产生耐药性、脂质体的控释性、细胞融和性特点，可实现单增李斯特菌生物被膜的靶向性控制。

附图说明

图1 凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌的杀菌曲线。

图2 凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用。

图3 凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对24 h培养形成的单增李斯特菌生物被膜的清除作用。

具体实施方式

本发明创造性的采用凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体进行抗单增李斯特菌及其生物被膜活性研究，为其在食品领域中应用奠定基础。以下是凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体抑制单增李斯特菌生物被膜形成的效果实施例。

实施例1：凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体的制备

磷脂酰乙醇胺(600 mg)溶于60 mL氯仿中，加入940 mg戊二酸酐、150 μL吡啶于20 ℃下反应5 h。反应液采用硅胶柱分离得戊二酰磷脂酰乙醇胺。取10 mg 冻干戊二酰磷脂酰乙醇胺分散于150 μL，加入2 mL 0.15 mol/L氯化钠，超声处理15 s。将反应液的pH调至3.5，加入20 mg1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺，震荡均匀。反应5 min后，加入1 mL 20 mg/mL的凝集素的PBS溶液，4 ℃反应2 h。产物用流动去离子水透析24 h，再用PBS缓冲液透析48h,冻于得到凝集素修饰的磷脂酰乙醇胺。取适量磷脂酰乙醇胺脂和胆固醇溶解于氯仿中, 旋转蒸发去除有机溶剂。加入2.048 mg/mL抗菌肽溶液(溶于PBS缓冲液中)，冰浴超声处理5 min，即得凝集素修饰胰岛素脂质体。

实施例2：凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

将凝集素修饰胰岛素脂质体溶液经0.22 μm滤膜过滤除菌，并采用灭菌PBS缓冲液倍比稀释。单增李斯特菌菌液接种于无菌TSB培养液中37 ℃培养过夜，所得菌体重悬至OD₆₀₀在0.1~0.3之间。依次将100>600值。对照组采用等量未包封抗菌肽的修饰型脂质脂质体代替抗菌肽脂质体混悬液。与初始值相比，OD₆₀₀不再增加的肽的最小浓度为抗菌肽脂质体的最小抑菌浓度(MIC)。从96孔板中依次取混合液接种于固体培养基，37>

实施例3：凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌的杀菌动力学

单增李斯特菌菌液接种于无菌TSB培养液中37℃培养过夜，采用PBS缓冲液洗涤3遍后重悬为至1.0×10⁷>

实施例4：凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌生物被膜形成的抑制

向灭菌平底96孔板每孔依次加入100μLTSB培养基、100 μL菌悬液和不同浓度的抗菌肽脂质体混悬液，37 ℃培养，分别培养1、2、4、6、8、10、12、24 h后，弃去板中培养液。灭菌PBS缓冲液清洗3次，30℃干燥30 min。采用0.2%结晶紫200 μL染色45 min，30℃干燥30 min干燥后加入200 μL 95%的乙醇，酶标仪于595 nm处测其吸光度值，实验平行3次。

实施例5：凝集素修饰型鳀鱼抗菌肽脂质体对单增李斯特菌生物被膜的清除

向灭菌平底96孔板每孔依次加入100 μL TSB培养基、100 μL菌悬液，37 ℃培养24 h。弃去培养液，灭菌PBS缓冲液清洗3次，每孔加入200 μL不同浓度的抗菌肽脂质体混悬液。作用1、2、4、6、8、10、12、24h后，弃去抗菌肽脂质体。灭菌PBS缓冲液清洗3次，55℃固定30 min。采用0.2%结晶紫200 μL染色45 min，干燥后加入200 μL 95%的乙醇，酶标仪于595 nm处测其吸光度值，实验平行3次。