KIF4A影响胃癌细胞迁移侵袭潜在作用机制的研究

摘要

胃癌是目前我国比较常见的恶性疾病之一，死亡率居各类癌症的第二位，成为严重威胁人类身体健康的重大疾病。虽然有关胃癌更好治疗方案的科学研究成果越来越多，但病人的5年存活率依然很低，特别是发生转移的恶性程度比较高的胃癌患者。由于以上原因，越来越多的新型生物靶点成为胃癌的病因学和组织病理学的研究对象，这些科学研究对严重威胁生命的胃癌疾病的早期诊断、有效治疗具有长远意义。
　　染色体驱动蛋白KIF4A在细胞周期的有丝分裂过程中始终保持与染色体臂结合。整个蛋白分子由1232个氨基酸组成，分子量约为140kDa，由球状的马达结构域、颈部的杆状区和尾部三部分组成。球状的马达结构域可以结合微管并朝向微管正极运动，颈部的杆状区主要帮助蛋白分子形成多聚体，该分子的尾部主要负责结合所运输的“货物”。KIF4A作为一种多功能动力蛋白分子，可以参与细胞有丝分裂过程中纺锤体的形成，染色体的凝集与分离，脑神经元的发育与再生，DNA的损伤应答，免疫细胞的活化，细胞骨架微管动态不稳定性的调控，细胞内的大分子运输等。KIF4A蛋白分子的功能多样性使该蛋白分子必然与人类各种重大疾病的发生发展相关。
　　众所周知，临床肿瘤的转移与多种因素相关，其中肿瘤细胞迁移、侵袭能力的改变直接影响肿瘤的扩散转移过程。而肿瘤细胞的迁移侵袭与细胞内各种细胞器及蛋白分子的重新分布以及细胞骨架结构的重新排列密切相关。驱动蛋白分子家族既是多种蛋白分子或亚细胞结构在细胞内转运的工具，又参与调控细胞内微管的动态不稳定性，直接影响细胞骨架的改变，因此与肿瘤细胞的迁移侵袭紧密相关。KIF4A作为驱动蛋白分子，对胃癌细胞迁移侵袭能力的调控可能主要表现在以下两个方面:一是KIF4A直接抑制细胞内微管远端(正极）的动态不稳定性，从而影响细胞骨架微管的结构重排，进而影响细胞的迁移侵袭能力;二是KIF4A负责转运黏着斑蛋白Supervillin(SVIL)，进而影响细胞迁移侵袭过程中黏着斑结构的形成，最终抑制细胞的迁移侵袭过程。
　　本研究工作主要从以下几个方面展开:
　　1.应用分子克隆技术构建质粒pGEXKG-SVILC302和pHIS8-SVILC302，然后诱导表达及纯化GST-SVILC302融合蛋白，并将该蛋白作为免疫原皮下注射新西兰大白兔，得到免疫血清;将HIS-SVILC302蛋白与Ni-NTA镍离子金属螯合柱进行交联，对SVIL多克隆抗体进行纯化。
　　2.为验证KIF4A对胃癌细胞迁移侵袭能力的负调控机制之一:直接抑制细胞内微管远端（正极）的动态不稳定性，从而影响细胞骨架微管的结构重排，进而影响细胞的迁移侵袭能力。我们通过免疫荧光染色技术鉴定了KIF4A蛋白分子定位于微管末端。
　　3.为验证KIF4A对胃癌细胞迁移侵袭能力的另一个负调控机制:负责转运黏着斑蛋白SVIL，进而影响细胞迁移侵袭过程中黏着斑结构的形成，最终抑制细胞的迁移侵袭过程。我们通过免疫共沉淀技术和免疫荧光染色技术证实了KIF4A与SVIL结合且共定位。
　　4.通过对瞬时敲降、过表达KIF4A蛋白分子的细胞和稳定敲降KIF4A的细胞株中Vinculin蛋白分子的计数，验证了KIF4A对胃癌细胞迁移侵袭过程中黏着斑结构形成的抑制作用。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 驱动蛋白简介

1．2 KIF4A蛋白分子简介

1．3 KIF4A蛋白分子的功能

1．3．1 KIF4A蛋白分子与肿瘤形成的关系

1．3．2 KIF4A蛋白分子对细胞骨架微管动态不稳定性的调控

1．3．3 KIF4A蛋白分子对染色体中板集合的调控

1．4 肿瘤转移过程及方式概述

1．4．1 肿瘤转移过程的简介

1．4．2 肿瘤转移方式的简介

1．5 细胞迁移及侵袭概述

1．5．1 细胞迁移过程简述

1．5．2 细胞侵袭过程简介

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验材料与细胞株

2．1．2 主要试剂与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 重组质粒pHIS8-SVILC302和pGEXKG-SVILC302的构建

2．2．2 GST-SVILC302的诱导表达及纯化和HIS-SVILC302的诱导表达及交联

2．2．3 SVIL多克隆抗体的制备及纯化

2．2．4 BGC细胞的培养及Turbofect方法转染siRNA和质粒

2．2．5 免疫荧光试验

2．2．6 免疫沉淀试验(IP)

2．2．7 聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹实验

第三章 结果与分析

3．1 酶切鉴定pGEXKG-SVILC302和pHIS8-SVILC302两个重组质粒的结果

3．2 制备与纯化GST-SVILC302融合蛋白的结果

3．3 诱导表达，裂解及交联HIS-SVILC302蛋白的结果

3．4 多克隆抗体的制备、提纯及效价检测结果

3．5 研究KIF4A在细胞内微管远端的定位情况

3．6 验证KIF4A与SVIL结合的结果

3．7 研究KIF4A在细胞黏着斑的定位情况

3．8 研究在BGC细胞中瞬时敲降和过表达KIF4A时，黏着斑蛋白Vincuiin量的变化情况

3．9 Western Blot鉴定稳定敲降KIF4A细胞株中的蛋白表达水平

第四章 讨论

4．1 本实验室具有制备多克隆抗体的优越性

4．2 需进一步明确KIF4A对肿瘤细胞迁移侵袭过程中黏着斑结构形成的抑制作用

4．3 探讨KIF4A负调控肿瘤细胞的迁移侵袭能力的潜在作用机制

参考文献

致谢

附录 攻读学位期间发表的学术论文目录和成果