枯草芽孢杆菌核黄素操纵子及呼吸链的代谢工程改造

摘要

本文围绕核黄素生物合成反应对产核黄素枯草芽孢杆菌进行了代谢工程改造,构建了一系列产核黄素枯草芽孢杆菌基因工程菌.研究了核黄素操纵子启动子替换及ribA基因的扩增对产核黄素工程菌核黄素生物合成的影响.通过bd氧化酶缺失对枯草芽孢杆菌呼吸链进行了改造.建立了枯草芽孢杆菌的生化反应网络,计算了工程菌的理论得率,并对呼吸链改造前后的工程菌在间歇培养过程中的代谢通量进行了比较分析.最后,通过原生质融合技术改进了产核黄素基因工程菌的性能.得到的主要结果如下: 利用枯草芽孢杆菌中组成型启动子SPO2和P43成功替换了核黄素操纵子的一级启动子ribP1.利用不同的整合型载体通过不同整合方式构建了系列核黄素操纵子一级启动子替换的产核黄素基因工程菌.在构建的所有工程菌中,以pUC18为克隆载体所构建的含核黄素操纵子整合型载体转化受体菌得到的工程菌B.subtilis PK具有最高的核黄素生物合成能力,与出发菌相比提高了10倍. 建立了产核黄素枯草芽孢杆菌生化反应网络模型,计算了工程菌B.subtilis PK的理论得率,得出该工程菌核黄素的最大合成速率为0.48mmol葡萄糖/g(CDW)/h,生物量的最大得率为0.47 g cell C/g glucose C. 研究了ribA基因的扩增对工程菌B.subtilis RH13、B.subtilis PK和B.subtilis PK/pXJ96核黄素生物合成能力的影响.结果表明:在核黄素操纵子表达量低的工程菌中,ribA基因的表达是核黄素过量合成的限制因素. 构建了系列cyd基因缺失的产核黄素工程菌.对比cyd基因缺失工程菌与其受体菌发现,cyd基因的缺失可使工程菌生长速率加快,最大生物量增加,菌体维持能降低,核黄素生物合成能力增强.通过对发酵副产物分析表明:cyd基因缺失工程菌中,乙酸含量明显降低,三羟基丁酮含量明显升高. 对工程菌B.subtilis PK/pXJ96和B.subtilis PK cyd/pXJ96通量分布的计算结果表明:cyd基因缺失可使工程菌中PP途径通量增强,用于生物量合成的葡萄糖百分比增加,并在一定程度上削弱了溢流代谢. 基于基因组重排原理改进了产核黄素工程菌的生产性状,通过基因组重排得到的B.subtilis RP/pXJ96在摇瓶发酵条件下可产核黄素5.6g/1,比B.subtilis RH33/pMX45提高了33﹪.B.subtilis RP/pXJ96的核黄素产率达到0.104 g核黄素/g葡萄糖,B.subtilis PK/pXJ96相比提高了42﹪.在5 L发酵罐流加发酵条件下发酵48小时,B.subtilis RP/pXJ96核黄素产量可达16g/1,产率为0.06 g核黄素/g 葡萄糖.

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1枯草芽孢杆菌简介

1.2原核生物中启动子的结构及调控方式

1.2.1启动子的结构

1.2.2启动子的结构对表达效率的影响

1.2.3启动子活性的调控方式

1.3枯草芽孢杆菌中的σ因子

1.3.1大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中RNA聚合酶的比较

1.3.2枯草芽孢杆菌中的σ因子

1.4枯草芽孢杆菌中的电子传递链

1.4.1枯草芽孢杆菌中的终端氧化酶

1.5核黄素的工业化生产

1.5.1核黄素的理化性质、功能与用途

1.5.2核黄素的工业化生产

1.6枯草芽孢杆菌中核黄素的生物合成

1.6.1核黄素操纵子结构

1.6.2核黄素操纵子结构基因所编码的酶及其功能

1.6.3核黄素生物合成途径

1.7产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌的构建

1.7.1基于诱变技术的产核黄素工程菌的构建

1.7.2基于基因工程技术的产核黄素工程菌的构建

1.7.3基于基因组重排技术的产核黄素工程菌的构建

1.8代谢工程

1.8.1代谢通量分析

1.8.2代谢通量分析最新进展

1.8.2产核黄素枯草芽孢杆菌代谢工程

1.9选题背景及研究思路

1.9.1选题背景

1.9.2技术路线与研究内容

第二章枯草芽孢杆菌启动子活性的比较

2.1实验材料

2.1.1质粒与菌种

2.1.2实验仪器

2.1.3实验试剂

2.1.4培养基

2.1.5主要溶液

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.2大肠杆菌转化

2.2.3大肠杆菌质粒的提取

2.2.4 DNA片段的回收纯化

2.2.5 PCR反应体系

2.2.6酶切体系

2.2.7内切酶的失活

2.2.8连接体系的建立

2.2.9 3'凹端的补平

2.2.10琼脂糖凝胶电泳

2.2.11枯草芽孢杆菌Spizizen转化

2.2.12枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取

2.2.13β-半乳糖苷酶活性测定

2.3实验结果与讨论

2.3.1启动子-LacZ融合片断的构建

2.3.2启动子活性的比较

2.4本章小结

第三章核黄素操纵子启动子替换对核黄素生物合成的影响

3.1实验材料

3.1.1质粒与菌种

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4培养基

3.1.5主要溶液

3.2实验方法

3.2.1利用α互补筛选目的转化子

3.2.2发酵液中核黄素的测定

3.2.4枯草芽孢杆菌质粒的大规模提取

3.2.5工程菌遗传稳定性的测定方法

3.3实验结果与讨论

3.3.1启动子-rib融合片断的构建

3.3.2含启动子-rib融合片断的枯草芽孢杆菌整合型质粒的构建

3.3.3含启动子-rib融合片断的产核黄素基因工程菌的构建

3.3.4产核黄素基因工程菌生物合成能力的比较

3.3.5 B.subtilis PK和B.subtilis RH：：[PRB63]n核黄素合成能力与菌种稳定性比较

3.3.6含P43-rib融合片断的游离型质粒的构建

3.3.7 pXJ96在产核黄素枯草芽孢杆菌中的表达

3.4本章小结

第四章产核黄素工程菌B. subtils PK代谢能力的研究

4.1实验材料

4.1.1菌种

4.2实验方法

4.2.1发酵液中葡萄糖含量的测定

4.3结果与讨论

4.3.1 B.subtilis PK代谢特性的考察

4.3.2 B.subtilis生化反应网络模型的建立

4.3.3 B.subtilis生化反应网络模型条件数的计算

4.3.4 B.subtilis PK理论值与实际值的比较

4.4本章小结

第五章ribA扩增对核黄素生物合成能力的影响

5.1实验材料

5.1.1质粒与菌种

5.1.2实验仪器

5.1.3实验试剂

5.1.4培养基

5.1.5主要溶液

5.2实验方法

5.2.1菌落PCR

5.2.2枯草芽孢杆菌总RNA的提取

5.2.3总RNA的分析和定量

5.2.4总RNA中基因组DNA的去除

5.3实验结果与讨论

5.3.1含P43-ribA融合片断整合型质粒的构建

5.3.2 ribA基因扩增的产核黄素工程菌的构建

5.3.3 ribA基因扩增的产核黄素工程菌核黄素生物合成能力比较

5.3.4 ribA基因扩增工程菌及其受体菌mRNA表达水平表征

5.4本章小结

第六章cyd基因敲除对工程菌代谢特性的影响

6.1实验材料

6.1.1质粒与菌种

6.1.2实验仪器

6.1.3实验试剂

6.1.4培养基

6.1.5主要溶液

6.2实验方法

6.2.1菌体生长曲线的测定

6.2.2发酵液中有机酸的测定

6.3实验结果与讨论

6.3.1cyd基因缺失菌株的构建

6.3.2 cyd基因缺失菌株及其受体菌生理参数表征

6.3.3 cyd基因缺失对工程菌维持能的影响

6.3.4 cyd基因缺失菌株及其受体菌核黄素生物合成能力比较

6.3.5采用有机培养基对cyd基因缺失工程菌及其受体菌进行发酵

6.3.6发酵液中有机酸的测定

6.3.7 cyd基因缺失工程菌及其受体菌代谢通量分析

6.4本章小结

第七章通过基因组重排技术改进产核黄素 B.subtilis的性能

7.1实验材料

7.1.1菌种

7.1.2实验仪器

7.1.3实验试剂

7.1.4培养基

7.1.5主要溶液

7.2实验方法

7.2.1原生质体的制备及再生

7.2.2原生质体融合方法

7.3实验结果与讨论

7.3.1亲株生长曲线的测定

7.3.2最适溶菌酶浓度的确定

7.3.3原生质体融合

7.3.4融合子发酵初筛和目的融合子的鉴定

7.3.5目的融合子与其亲株部分特性的比较

7.3.6 B.subtilis RP/pXJ96的流加发酵

7.4本章小结

第八章结论与展望

8.1结论和创新点

8.1.1主要结论

8.1.2创新点

8.2展望

参考文献

附录1理论通量计算程序

附录2实际通量计算程序

发表论文和科研情况说明

致 谢