重组枯草芽孢杆菌生产核黄素发酵优化及代谢组学研究

摘要

本文在重组B.subtilis RH44产核黄素发酵优化的基础上，基于酶活测定、代谢通量分析等方法对具有显著影响的培养基成分在核黄素生产中的作用机理进行探讨，并利用LC-MS分析手段对产核黄素B.subtilis RH4的代谢物组学进行研究。 首先通过一系列统计实验设计方法对核黄素发酵培养基组成进行优化。根据Plackett-Burman实验确定影响核黄素生成的5个重要成分分别为葡萄糖、NaNO3、K2HPO4、ZnSO4和MnCl2；然后，通过中心组成(CCD)设计和响应面方法(RSM)获得核黄素生产的优化培养基。该优化培养基在摇瓶培养中可获得核黄素6.65g/L。采用RSM和神经网络(ANN)耦合遗传算法(GA)两种方法共同优化B.subtilis RH44在5 L罐中间歇发酵核黄素的培养参数(pH、接种量、通气量、搅拌速率和温度)。ANN-GA方法可获得核黄素最大产量为7.53 g/L,比RSM法高出8.6％。 对比研究了间隔补料、恒速补料和葡萄糖限制补料三种间歇补料方式对B.subtilis RH44.发酵生产核黄素的影响。结果表明葡萄糖限制间歇补料模式(葡萄糖浓度维持在5～10 g/L)为最适合的补料方式。研究pH对B.subtilis RH44间歇补料发酵生产核黄素的影响表明，菌体生长的最适pH为6.8，但在pH7.2时，核黄素浓度和核黄素合成酶活性达到最大。使用pH转换策略可明显改善核黄素的生产，最大的核黄素浓度比常数pH操作的最好结果提高了13.3％。pH对副产物浓度及相关酶比活的影响表明优化的pH转换策略能够在一定程度上抑制副产物的形成和积累。用NH4OH代替NaOH调节pH，pH转换策略可使核黄素浓度进一步提高，48h达到17.4 g/L。 初步探讨了对B.subtilis RH44产核黄素具有显著促进作用的三种培养基成分(NaNO3、ZnSO4和MnCl2)的作用机理。对比B.subtilis 168和B.subtilis RH44在NH4+存在时利用NO3-的情况说明B.subtilis RH44已经解除了NH4+对NO3-利用的抑制作用。进一步代谢通量分析表明，优化氮源使发酵中后期的葡萄糖代谢流由EMP途径向PP途径迁移，使得更多的通量流向核黄素合成的途径。通过酶学研究表明Mn2+激活了PP途径的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的比活性，并抑制形成乙酸的相关酶磷酸转乙酰酶(PTA)的比活性。根据预测的B.subtilis GTP环水解酶Ⅱ(GCHⅡ)的立体结构，推断Zn2+对核黄素生产的促进作用可能与GCHⅡ有密切关系。建立产核黄素B.subtilis代谢网络，利用代谢通量分析进一步研究Mn2+和Zn2+对核黄素生产过程中代谢流的影响。建立利用LC-MS分析手段进行产核黄素B.subtilis代谢物组学研究的方法。对不同发酵阶段的胞内代谢物负离子ESI-MS数据进行主成分分析，结果表明代谢物组学方法可以区分不同发酵阶段的代谢产物。通过标样和二级质谱对代谢物进行定性分析，可初步确定16种代谢物。根据代谢物轮廓分析分别对比研究不同发酵时间、不同氮源和不同菌种的代谢物差异，并推测出B.subtilis RH44合成核黄素的可能限制因素。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1核黄素的工业化生产

1.1.1核黄素的理化性质、功能与用途

1.1.2核黄素的工业化生产

1.2枯草芽孢杆菌中核黄素的生物合成

1.2.1枯草芽孢杆菌简介

1.2.2核黄素生物合成途径

1.2.3前体物GTP合成的代谢调节机制

1.2.4核黄素操纵子结构基因所编码的酶及其功能

1.2.5产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌的构建

1.3微生物发酵过程优化策略

1.3.1统计学方法优化发酵工艺

1.3.2神经网络与遗传算法偶联

1.3.3核黄素发酵优化

1.4间歇补料策略和细胞高密度培养

1.4.1间歇补料的特点

1.4.2间歇补料发酵用于枯草芽孢杆菌细胞高密度培养

1.5代谢工程及代谢通量分析

1.5.1代谢通量分析

1.5.2枯草芽孢杆菌代谢工程

1.5.3代谢副产物的影响

1.6代谢组学研究方法及应用

1.6.1代谢组学的提出

1.6.2代谢组学的研究方法

1.6.3.不同分析方法在微生物代谢组学研究中的应用

1.6.4代谢组学研究的发展前景

1.7选题背景及研究思路

1.7.1选题背景

1.7.2技术路线与研究内容

第二章统计学方法优化核黄素发酵培养基成分

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2实验仪器

2.1.3实验试剂

2.1.4培养基

2.1.5培养方法

2.2实验方法

2.2.1发酵液中核黄素的测定

2.2.2实验设计和数据分析

2.3实验结果与讨论

2.3.1氮源选择预实验

2.3.2 Plackett-Burman实验

2.3.3中心组成设计及响应面方法

2.3.4.证实实验

2.4本章小结

第三章对比研究响应面法和神经网络优化核黄素发酵培养参数

3.1实验材料

3.1.1菌种

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4培养基和培养条件

3.2实验方法

3.2.1发酵液中核黄素的测定

3.2.2实验设计和数据分析

3.3实验结果与讨论

3.3.1中心组成设计

3.3.2 RSM模型

3.3.3 ANN-GA模型

3.3.4对比和证实实验

3.4本章小结

第四章间歇补料策略对枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的影响

4.1实验材料

4.1.1菌种

4.1.2实验仪器

4.1.3实验试剂

4.1.4培养基和培养条件

4.2实验方法

4.2.1细胞干重(CDW)的测定

4.2.2发酵液中葡萄糖的测定

4.2.3发酵液中副产物的测定

4.3实验结果与讨论

4.3.1核黄素间歇发酵

4.3.2核黄素补料发酵

4.4本章小结

第五章核黄素发酵过程中分阶段调控pH的研究

5.1实验材料

5.1.1菌种

5.1.2实验仪器

5.1.3实验试剂

5.1.4培养基和培养条件

5.2实验方法

5.2.1细胞提取液制备

5.2.2核黄素合成酶的测定

5.2.3乙酸形成酶的测定

5.2.4总蛋白的测定

5.3实验结果与讨论

5.3.1未控制pH操作中初始pH0的影响

5.3.2恒定pH操作的影响

5.3.3 pH转换操作的影响

5.3.4 pH对核黄素产量和副产物的影响

5.3.5 pH对副产物形成酶比活的影响

5.3.6 pH转换策略改善核黄素生产

5.4本章小结

第六章培养基成分显著影响核黄素合成的机理研究

6.1实验材料

6.1.1菌种

6.1.2实验仪器

6.1.3实验试剂

6.1.4培养基

6.2实验方法

6.2.1 NO3-、NO2-和NH4+离子的测定

6.2.2酶活的测定

6.3实验结果与讨论

6.3.1 B.subtilis产核黄素枯草芽孢杆菌生化反应网络模型的建立

6.3.2无机氮源对B.subtilis Pd-144生产核黄素及代谢通量的影响

6.3.3 Zn2+和Mn2+对核黄素生产及代谢通量的影响

6.4本章小结

第七章基于LC／MS的产核黄素枯草芽胞杆菌代谢组学的研究

7.1实验材料

7.1.1菌种

7.1.3实验试剂

7.1.4培养基

7.2实验方法

7.2.1数据的预处理

7.2.2数据的识别

7.2.3 MS条件

7.3结果与讨论

7.3.1提取方法的选择

7.3.2流动相组成的选择

7.3.3色谱柱的选择

7.3.4紫外检测的选择

7.3.5流动相pH的影响

7.3.6流动相洗脱梯度的选择

7.3.7胞内代谢物的初步确定

7.3.8不同培养时间代谢物的变化

7.3.9不同氮源对代谢物的影响

7.3.10不同菌种对代谢物的影响

7.4本章小结

第八章结论与展望

8.1结论和创新点

8.1.1主要结论

8.1.2创新点

8.2展望

参考文献

附 录

发表论文和参加科研情况

致 谢