酿酒酵母遗传操作方法研究及乙醇发酵高产菌株构建

摘要

随着地球上化石能源(石油、煤炭、天燃气等)的日趋枯竭和全球环境保护意识的不断加强，用生物乙醇(也称燃料乙醇)取代部分汽油已经成为一项重要的可再生能源战略。由于技术上的原因，目前燃料乙醇的生产主要是通过酿酒酵母对淀粉质或糖质原料的发酵来实现。以淀粉质或糖质原料为碳源进行乙醇发酵，原料成本在生产总成本中占很大比例，这在一定程度上限制了燃料乙醇工业的发展。因此，提高酿酒酵母乙醇发酵过程中的原料利用率(糖—醇转化率)以及降低生产过程中的能耗(如：缩短发酵周期、采用浓醪发酵等)是关系到淀粉质及糖质原料乙醇发酵行业发展的重要课题。然而，酿酒酵母乙醇发酵的糖—醇转化率、发酵速率以及对乙醇的耐受力是受多基因调控的复杂遗传性状，很难通过传统的诱变育种、代谢工程以及针对特定基因或代谢途径的其它遗传操作方法进行改善。因此，采用全基因组系统工程的方法对酿酒酵母进行遗传改造无疑是解决上述问题的有效途径。
　　 本研究以YCplac33为载体，构建带有受半乳糖诱导启动子调控的HO基因的质粒YCplac33-GHK。将该质粒转入酿酒酵母菌株W303，通过半乳糖诱导HO基因转录来实现转化菌株交配型的转换。通过菌落PCR分析菌株的交配型，选择适当交配型的酵母菌株进行有性接合，获得多倍体菌株HLH33和HLH34。实验结果表明：在浓醪发酵中，菌株HLH33和HLH34分别比对照菌株W303的乙醇产量提高了1.29％和3.57％；酵母菌株的乙醇产量和对乙醇及高渗透压的抗性随染色体倍数的增加而提高和增强。
　　 用芬苯达唑(methyl benzimidazole-2-yl-carba-mate，MBC)处理多倍体菌株HLH34使之发生染色体缺失，得到一株乙醇发酵特性显著改善的非整倍体酵母菌株HLH34-M。实验结果表明：在浓醪发酵中，菌株HLH34-M与对照菌株W303相比，发酵终点残糖降低了58.70％，乙醇产量提高了5.33％。同时，菌株HLH34-M对乙醇及高渗透压的抗性明显增强。研究结果证明，非整倍体菌株可以显著地改善酿酒酵母的乙醇发酵生产特性。
　　 用常规重组DNA技术将编码全局转录因子的基因SPT15和SPT3分别克隆到载体YEplac195上，得到质粒YEplac195-SPT15和YEplacl95-SPT3；采用PCR介导的定点诱变技术，获得SPT15的等位基因spt15(Phe177Ser、Tyr195His、Lys218Arg)，并将其克隆到YEplac195载体上，得到质粒YEplac195-spt15；此外，分别将SPT15和SPT3以及spt15和SPT3共同克隆到YEplac195上，构建出质粒YEplac195-SPT15-SPT3和YEplac195-spt15-SPT3。上述所有质粒上的SPT15和spt15均由TEF1强启动子调控，而SPT3则由PGK1强启动子调控。将所构建的质粒分别转入菌株W303，并对转化子的乙醇发酵能力和乙醇及高渗透压的抗性进行考察。实验结果表明：与对照菌株W303相比，过量表达转录因子SPT15和spt15的菌株乙醇产量分别提高了1.14％和0.23％；共同过量表达SPT15和SPT3及共同过量表达spt15和SPT3的菌株乙醇产量分别提高了2.05％和1.70％；过量表达转录因子SPT3的菌株乙醇产量提高了1.25％，而且该菌株具有较强的乙醇及高渗透压的抗性。研究结果说明：在本研究实验条件下，对于SPT15和SPT3的遗传操作可在一定程度上提高酵母的乙醇发酵能力。
　　 在确定甲基磺酸乙酯(Ethyl methane sulphonate，EMS)最佳诱变剂量的基础上，对双倍体酵母菌株W303进行诱变，获得具有充分遗传多样性的菌株群；通过三轮有性重组进行基因组重排，构建出具有优良特性的酿酒酵母乙醇发酵菌株HLHS3-7。实验结果表明：在浓醪发酵中，菌株HLHS3-7比对照菌株W303的乙醇产量提高了8.88％，残糖降低了64.37％，发酵周期缩短了10小时，而且对乙醇及高渗透压的抗性显著增强。研究结果证明：本研究采用的策略是一种有效的酿酒酵母乙醇发酵菌株改造方法。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1.1燃料乙醇生产概况

1.1.1工业乙醇生产

1.1.2发酵法生产乙醇

1.2酿酒酵母菌株改造的遗传操作策略

1.2.1随机诱变

1.2.2进化工程

1.2.3代谢工程

1.2.4有性重组

1.2.5基因组重排

1.3全局转录因子及整体转录系统工程

1.3.1转录因子SPT15

1.3.2转录因子SPT3

1.3.3整体转录系统工程(gTME)

1.4酿酒酵母基因组、交配型及染色体倍数

1.4.1酿酒酵母基因组

1.4.2酿酒酵母交配型

1.4.3 HO基因

1.4.4多倍体酿酒酵母

1.4.5芬苯达唑及非整倍体酿酒酵母

1.5本文的研究背景、内容及目的

1.5.1研究背景

1.5.2主要研究内容及目的

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒、菌种及引物

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4酶制剂

2.1.5培养基

2.1.6主要溶液

2.2主要基因操作方法

2.2.1大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.2大肠杆菌转化(CaCl2法)

2.2.3电转化法

2.2.4小规模提取大肠杆菌质粒法(CTAB法)

2.2.5 PCR反应

2.2.6定点突变方法

2.2.7 DNA片段回收纯化

2.2.8酶切反应

2.2.9 DNA连接反应

2.2.10 DNA纯化

2.2.11 DNA琼脂糖凝胶电泳

2.2.12酵母细胞转化

2.2.13酵母染色体快速分离

2.2.14酵母等位基因分离及遗传分析

2.2.15不同交配型酵母细胞之间的杂交

2.2.16验证酵母交配型

2.2.17 MBC处理方法

2.2.18酵母EMS诱变

2.2.19酵母高效产孢法

2.2.20孢子纯化方法

2.3发酵过程的准备及主要分析方法

2.3.1发酵培养基制备

2.3.2菌种扩大培养与接种

2.3.3发酵样品的收集及细胞生长状态的测定

2.3.4还原糖的测定(DNS法)

2.3.5乙醇的测定

2.3.6抗性分析

第三章多倍体与非整倍体酿酒酵母菌株的构建及发酵特性研究

3.1酿酒酵母发酵后期的影响因素

3.1.1酿酒酵母的乙醇发酵

3.1.2酿酒酵母发酵后期的影响因素

3.2质粒YCplac33-GHK的构建

3.3多倍体酵母菌株的构建

3.3.1多倍体酵母菌株的构建

3.3.2多倍体细胞的形态大小

3.4非整倍体酵母菌株的构建

3.5多倍体及非整倍体酵母菌株乙醇发酵

3.5.1多倍体酵母菌株乙醇发酵

3.5.2非整倍体酵母菌株乙醇发酵

3.6实验结果分析

3.6.1重组菌株对乙醇及高渗透压的抗性分析

3.6.2实验结果分析

3.7本章小结

第四章全局转录因子调控对乙醇发酵的影响

4.1质粒的构建

4.1.1质粒YEplac195-SPT15-SPT3的构建

4.1.2质粒pUC18-spt15的构建

4.1.3质粒YEplac195-spt15-SPT3的构建

4.1.4质粒YEplac195-spt15的构建

4.1.5质粒YEplac195-SPT15的构建

4.1.6质粒YEplac195-SPT3的构建

4.2菌株的构建

4.3乙醇发酵

4.4实验结果分析

4.4.1重组菌株对高渗透压及乙醇的抗性分析

4.4.2实验结果分析

4.5本章小结

第五章采用基因组重排技术改造酿酒酵母菌株及其乙醇发酵特性的研究

5.1 EMS最佳剂量的确定

5.2原始突变群体的获得

5.2.1选择平板

5.2.2 EMS诱变

5.3基因组重排

5.3.1第一轮基因组重排

5.3.2第二轮基因组重排

5.3.3第三轮基因组重排

5.4乙醇发酵

5.5实验结果分析

5.5.1重组菌株对高渗透压及乙醇的抗性分析

5.5.2实验结果分析

5.6本章小结

第六章总结与展望

6.1主要研究工作总结

6.2主要创新点

6.3相关工作的前景展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文和参加科研情况

附录

致谢