葡萄球菌分离株肠毒素基因型分析及两种毒素的表达纯化

摘要

葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)是由葡萄球菌产生的一类外毒素，是引起人类食源性疾病的重要致病因子。葡萄球菌肠毒素基因可通过噬菌体转导，整合子、转座子、质粒等分子元件的转移导致新型肠毒素的不断产生，了解新型肠毒素蛋白的结构与功能，建立相应的检测评价方法具有重要意义。
　　 本研究通过生物信息学分析，设计了不同葡萄球菌肠毒素基因(sea，see，seb，sec，ced，tsst，seg，seh，sei, selj,selk，sell, selm，seln，selo，selq，selu)的PCR检测引物，通过葡萄球菌DNA提取、PCR条件优化等，建立了16种不同肠毒素基因型特异性检测的PCR方法。
　　 应用建立的基因分型检测方法，对分离自生鲜牛奶、奶酪、土壤，人、猪、牛、羊、鸡等动物性产品或动物体表、环境中122株葡萄球菌分离株肠毒素基因型的检测，初步了解了葡萄球菌国内分离株肠毒素基因的分布情况，结果表明：(1)除selj型阴性外，其它16种基因型均有检出，95.9％的葡萄球菌含有至少一种SE基因，110株含有一种以上SE基因(90.2％)，其中47.5％的菌株携带至少5种以上的肠毒素基因型，表明肠毒素基因簇(egc)广泛存在于葡萄球菌国内分离株。肠毒素型检出率最高的三种肠毒素基因为tsst，sei和seb，分别为62.3％，54.1％和46.7％，未检出selj型肠毒素。(2)除金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、中间葡萄球菌、表皮葡萄球菌等已报道的葡萄球菌外，我们分离的非致病性葡萄球菌菌株(猪葡萄球菌、华纳氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、克氏葡萄球菌、鸡葡萄球菌、耳葡萄球菌)也检测到多种葡萄球菌肠毒素基因。动物非致病性葡萄球菌分离株可携带多种肠毒素基因，为食品安全带来新挑战。(3)葡萄球菌菌株的致病性与其种类、携带肠毒素的种类、分离来源密切有关。分离自病样，感染能力较强的菌株，产生的肠毒素种类和数量都多；猪源和鸡源的葡萄球菌携带除了selj以外的16种肠毒素基因型，兔源和人源携带了除selj和sec以外的15种。
　　 通过设计sea、selo肠毒素基因表达引物，从含有肠毒素基因簇的葡萄球菌ZNZ2-3分离株成功克隆了两种葡萄球菌肠毒素sea和selo基因，sea基因与GenBank已报道序列完全一致，selo发生点突变，但该突变为同义突变。应用克隆基因构建了两种肠毒素的融合表达载体pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO，转化大肠杆菌BL21宿主菌，经诱导后获得了重组融合蛋白，重组蛋白分别占菌体蛋白的26％和22％。经亲和层析纯化获得重组肠毒素蛋白，Western-Blot检测表明，表达的重组蛋白能够被SEA和SEO阳性血清识别，具有良好的抗原性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1葡萄球菌及食物中毒

1.1.1葡萄球菌分类

1.1.2金黄色葡萄球菌基本特征

1.1.3葡萄球菌的生长与生态

1.1.4葡萄球菌与食物中毒

1.1.5葡萄球菌肠毒素研究概况

1.1.6葡萄球菌肠毒素的种类

1.1.7肠毒素蛋白

1.1.8葡萄球菌肠毒素编码基因

1.1.9影响葡萄球菌肠毒素产生的因素

1.2葡萄球菌肠毒素的检测技术

1.2.1动物学实验

1.2.2免疫学方法

1.2.3超抗原技术

1.2.4分子生物学方法

1.2.5生物传感器技术

1.3展望

1.4葡萄球菌肠毒素研究的目的和意义

第二章葡萄球菌肠毒素基因检测PCR技术的建立

2.1实验材料

2.1.1实验菌种

2.1.2主要试剂

2.2试验方法

2.2.1生物信息学分析，设计合成不同肠毒素PCR引物

2.2.2葡萄球菌肠毒素模板DNA的制备

2.2.3 PCR确证葡萄球菌及对各型肠毒素的检测

2.3结果与分析

2.3.1葡萄球菌分子生物学方法鉴定

2.3.2 DNA提取方法的确定

2.3.3 PCR程序的确定

2.3.4各型葡萄球菌肠毒素PCR检测结果

2.4讨论

2.4.1葡萄球菌肠毒素基因分布的特点

2.4.2葡萄球菌肠毒素型之间的关系

2.4.3肠毒素分布与不同种、菌株分离来源之间的关系

2.4.4关于葡萄球菌肠毒素的扩增

2.5小结

第三章葡萄球菌肠毒素sea、selo基因的克隆及分析

3.1实验材料

3.1.1载体与菌株

3.1.2主要试剂

3.2实验方法

3.2.1肠毒素SEA、SEO表达引物的设计

3.2.2葡萄球菌肠毒素模板DNA的制备

3.2.3 sea和selo基因PCR扩增的反应体系及反应程序

3.2.4目的片段的回收

3.2.5目的片段与T载体的连接

3.2.6感受态细胞E.coli DH5α的制备

3.2.7连接产物的转化

3.2.8T-sea和T-selo重组质粒的鉴定

3.2.9 sea和selo的生物信息学分析

3.3结果与分析

3.3.1 SEA和SEO的信号肽分析及引物设计

3.3.2葡萄球菌型肠毒素基因sea、selo的PCR扩增

3.3.3T-sea和T-seo重组质粒的鉴定

3.3.4 T-sea和T-selo测序结果

3.3.5 sea和selo的生物信息学分析

3.4讨论

3.4.1克隆基因sea、selo的比对分析

3.4.2肠毒素基因sea、selo的生物信息学特征

3.5小结

第四章葡萄球菌sea、selo基因的原核表达与纯化

4.1实验材料

4.1.1载体与菌株

4.1.2主要试剂

4.2实验方法

4.2.1 sea和selo原核表达载体的构建

4.2.2质粒的制备

4.2.3目的基因的的酶切与表达载体的连接

4.2.4连接产物的转化

4.2.5重组质粒鉴定

4.2.6重组表达质粒的转化

4.2.7重组表达菌的诱导表达

4.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

4.2.9表达蛋白的纯化

4.2.10 GST-SEA和GST-SEO阳性血清的制备

4.2.11 Western-Blot

4.3结果

4.3.1重组质粒鉴定

4.3.2基因工程重组菌的诱导表达和纯化

4.3.3重组蛋白的特异性鉴定

4.4讨论

4.4.1成功构建了sea和selo的表达载体

4.4.2关于表达载体的选择

4.4.3重组蛋白的表达、纯化及其稳定性

4.5小结

第五章结论

参考文献

附录

发表论文和科研情况说明

致 谢