综合质谱法对生物活性多肽解析表征的研究

摘要

现代质谱技术具备高灵敏度、高精确度、高通量、高度自动化等诸多优势,在蛋白质组学、神经化学、生理学、核酸化学、细胞信号转导等生命科学领域得到了广泛应用。本文采用综合质谱法及其相关技术,对六类具有复杂结构的生物活性多肽样品:抗癌海洋环肽(第二章)、环肽线性前体(第三章)、二硫键神经肽(第四章)、大型神经肽(第五章)、合成消旋肽(第六章)、酶解肽(第七章)进行解析研究,旨在开发基于综合质谱法的新颖肽谱分析方法学,并深入研究与质谱学密切相关的多肽质谱碎裂机理,同时在各章中穿插介绍了环肽的合成、交联酶聚体的制备、反相色谱保留机理、神经肽生理学测试等辅助性研究工作。
　　 综合质谱法有效地整合、运用多种样品前处理、样品分离等手段,质谱电离源、离子分离器、质量分析器等技术,数据分析、肽测序软件、数据库搜索等工具,气相离子化学、酶学、MALDI基质化学、MALDI成像学等学科;并将这些相关技术、手段、工具、理论应用于复杂多肽样品的表征及其生理学活性的研究。本研究所建立的方法学与理论体系以及具体研究内容与结论如下:
　　 第一,采用多级质谱法对具有抗癌活性的海洋环肽进行序列测定,依据bx→bx-1断裂路径,每一级MS由b离子的C端碰撞掉一个氨基酸残基,得到2套b离子序列信息,由此测得环肽序列;利用半经验量子化学计算了断裂与重排的路径和机理,并尝试提出过渡结构假设;研究了环肽CAD中选择性开环的现象,提出Asn诱导开环的碎裂路径。
　　 第二,针对多级质谱测序中观察到的b离子丢失中部氨基酸残基的现象,提出b离子环化碎裂路径,并设计多项实验加以验证,包括肽链N端乙酰化、多级CAD、设计重排b离子、调节CAD活化时间、CAD碎裂合成环肽;观察到由ESI产生的质子化环肽的碎裂模式与b离子环化产物的碎裂模式一致,有力证明了所提出的b离子环肽中间体以及环化路径假设的成立;尝试设计实验探索此环化路径的规律性,并提炼出反应开环过程规律性的“Pro和Asn/Gin效应”;此外,观察到a型离子丢失中部残基的现象,提出a离子环化碎裂路径;此a离子环肽中间体为固定电荷结构,故不可以被“Pro效应”影响,导致易于在肽键Pro-Xxx而不是Xxx-Pro开环。
　　 第三,建立还原基质法对含二硫键多肽进行扫描,结合表达序列数据库对肽序列预测,在蓝蟹围心器提取液中发现并解析了新颖的咽侧体抑制素CbAST-C1;电生理学实验结果证明此咽侧体抑制素肽都可以阶段性地抑制蓝蟹口胃神经节的幽门节律;应用肽浓度为10-6M,当起始幽门节律大于0.8Hz时,两个AST肽对幽门节律的影响很小;但当起始幽门节律小于0.7 Hz时,两肽均可完全抑制幽门节律。
　　 第四,建立多面质谱法对蓝蟹神经组织中CHH家族肽进行表征与解析;从窦腺中鉴定出了SG-CHH、SG-MIH、SG-CPRP、SG-tCPRP和SG-PPRP;从围心器中鉴定出了PO-CHH、PO-CPRP和PO-tCPRP;建立酶解后甲醛同位素标记法对SG中的CHH家族肽和相关大型肽进行定量分析,并建立质谱成像法对PO中CHH家族肽和相关大型肽进行分布分析,为今后生理学活性研究奠定了方法学基础。
　　 第五,针对弱疏水性合成七肽,提出“早期吸附”过程,以此优化色谱条件得到4个峰形良好的色谱峰;质谱分析表明:4谱峰具有相同的m/z761.5[M+H]+值,对每一消旋产物进行在线多肽测序;利用质谱、色谱相结合的方法对固相合成关键性问题进行研究,包括水杨醛法测定树脂取代率,合理搭配缩合体系提升酯化缩合效率至99％,合理选择氨基酸侧链保护剂,减少合成的预活化时间为5分钟以避免了消旋化。
　　 第六,基于胰蛋白酶CLEA技术的制备工艺、性质及结构形貌的系统研究,建立CLEA板上酶解法用于酶解肽谱的解析,考察了CLEA抗自水解性能、高温酶解稳定性以及CLEA颗粒对MALDI电离的影响程度;使用7种蛋白样品测试所建立的CLEA-trypsin板上酶解法,可得到同量级的多肽指纹图谱解析结果:46％的平均序列覆盖率,14个平均酶解肽段数目;与传统的14小时酶解相比,该法显著提高了分析通量(5 min),减少了样品消耗量(下至4 pmol)。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 文献综述

1.1 生物质谱法

1.1.1 质谱两大“软电离”离子源

1.1.2 本研究中几种常规质谱仪简介

1.1.3 质谱法测序多肽的原理

1.1.4 基于离子阱的多级质谱法

1.1.5 基于同位素标记的定量质谱法

1.1.6 成像质谱法

1.2 海洋环肽的研究现状

1.2.1 海洋环肽的研究进展

1.2.2 线肽、环肽序列测定的异同

1.3 甲壳类神经肽组学的研究现状

1.3.1 神经肽

1.3.2 甲壳类生物的神经系统

1.3.3 咽侧体抑制素的研究进展

1.3.4 甲壳类高血糖荷尔蒙家族肽的研究现状

1.4 质谱中多肽的碎裂机理

1.4.1 环化反应的总体模式

1.4.2 文献中关于环肽碎裂的报道

1.4.3 包含二硫键多肽的质谱碎裂及表征

1.5 蛋白组学中酶解肽的制备与质谱分析

1.5.1 蛋白组学中酶解多肽的解析

1.5.2 固定化酶在蛋白组学中的应用

1.6 目前质谱法在生物活性多肽研究中存在的问题

1.7 本课题主要研究的内容

第二章 多级质谱法测序抗癌环肽及离子碎裂机理研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和材料

2.2.2 线肽的固相合成

2.2.3 环肽的合成

2.2.4 质谱条件、碎片离子命名及半经验量子化学计算

2.3 结果与讨论

2.3.1 环肽线性前体肽序列的质谱测定

2.3.2 合成环肽的质谱全扫描表征

2.3.3 环肽CAD碎裂路径与机理

2.3.4 环五肽的多级质谱测序

2.3.5 环六肽的多级质谱测序

2.3.6 环七肽的多级质谱测序

2.3.7 环肽多级CAD中b型离子的重排

2.3.8 质子化环肽选择性开环的研究

2.4 小结

第三章 多级质谱碰撞活化中肽碎片的异常环化机理研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和材料

3.2.2 肽合成与修饰

3.2.3 质谱条件、肽碎片离子命名

3.3 结果与讨论

3.3.1 b型离子环化现象的发现

3.3.2 b型离子环化反应的推演

3.3.3 b型离子环化反应机理

3.3.4 b型离子环化机理的实验验证

3.3.5 b型离子环化所诱导中部残基丢失的规律性

3.3.6 a型离子的环化反应研究

3.4 小结

3.4.1 b型离子

3.4.2 a型离子

第四章 还原性基质法对新型咽侧体抑制素的质谱表征及生理活性研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和材料

4.2.2 动物解剖与组织采集

4.2.3 组织提取液的制各与色谱纯化

4.2.4 MALDI-FTMS质谱条件与组织上原位分析

4.2.5 MALDI-TOF/TOF质谱条件与还原基质法

4.2.6 NanoLC-ESI-QTOF质谱条件

4.3 结果与讨论

4.3.1 还原性基质DAN用于二硫键肽检测的可行性

4.3.2 还原性基质DAN法的建立

4.3.3 新型咽侧体抑制素CbAST-C1的发现与解析

4.3.4 咽侧体抑制素对幽门节律的影响

4.3.5 咽侧体抑制素进化谱线与生理活性的讨论

4.3.6 用于二硫键肽表征新方法的开发

4.4 小结

第五章 多面质谱法解析甲壳类高血糖荷尔蒙肽族

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂和材料

5.2.2 动物解剖、组织采集、神经肽提取

5.2.3 质谱条件

5.2.4 胰蛋白酶解

5.3 结果与讨论

5.3.1 多面质谱法对CHH家族肽表征方法学的建立

5.3.2 多面质谱法方法学的讨论

5.3.3 多面质谱法对CHH家族肽及相关大型肽的鉴定结果

5.3.4 多面质谱法方法学过程与讨论

5.3.5 甲醛同位素标记定量方法学的初探

5.3.6 成像质谱法确定CHH家族肽分布的初探

5.4 小结

第六章 液质联用法对合成肽及消旋产物的分离鉴定

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 多肽的化学合成

6.2.2 质谱条件

6.3 结果与讨论

6.3.1 合成线性多肽的色谱、质谱表征

6.3.2 串联质谱法测定合成线性多肽的序列

6.3.3 氨基酸在树脂上取代率的测定

6.3.4 第一个氨基酸与树脂的缩合反应

6.3.5 氨基酸侧链保护清除剂的选择

6.3.6 含消旋产物亲水性多肽的反向色谱行为

6.3.7 含消旋产物亲水性多肽的色谱条件优化

6.3.8 含消旋产物亲水性多肽的液汁联用表征

6.3.9 化学合成多肽中氨基酸的消旋化

6.4 小结

第七章 CLEA板上酶解法在蛋白组学复杂肽谱分析中的应用

7.1 引言

7.2 实验部分

7.2.1 胰蛋白酶CLEA的制备及活性检测

7.2.2 胰蛋白酶CLEA的表征

7.2.3 质谱条件

7.2.4 CLEA板上酶解法

7.3 结果与讨论

7.3.1 胰蛋白酶CLEA制备条件优化

7.3.2 胰蛋白酶CLEA性质研究

7.3.3 胰蛋白酶CLEA的形貌表征

7.3.4 胰蛋白酶与CLEA-trypsin自水解研究

7.3.5 CLEA-trypsin板上酶解初探

7.3.6 CLEA-trypsin板上酶解条件优化

7.4 小结

7.4.1 CLEA-trypsin的制备工艺开发

7.4.2 CLEA-trypsin板上酶解法

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 主要创新点

8.3 展望

参考文献

博士研究生期间发表论文和科研情况说明

致谢