靶向AKT通路的非编码RNA联合化疗抑制乳癌细胞生长的研究

摘要

AKT通路调节肿瘤细胞的增殖、存活,与肿瘤的发生发展密切相关。阻断该通路的高活性,将有可能提高肿瘤治疗的效果。本课题将应用靶向AKT通路的非编码RNA技术联合化疗,研究其对人乳腺癌细胞MCF-7的体外抑制作用。
　　 应用靶向P13Kp85a的siRNA敲低在MCF-7细胞中的表达。MTT结果显示P13Kp85α siRNA组细胞生长速度明显小于对照组和空载体转染组;流式细胞术表明细胞周期阻滞在G0/G1期,凋亡比例显著提高。免疫荧光及Western blot结果均显示PI3Kp85α、p-AKT、AKT-2、Ki67和Bcl-2蛋白表达的强度均减弱。
　　 Oligofectamine转染靶向AKT1的siRNA至MCF-7细胞,RT-PCR结果表明AKT1 siRNA组可以有效敲低AKT1的表达水平;MTT结果显示AKT1 siRNA组细胞增殖率显著降低:流式细胞术分析细胞在G0/G1期阻滞,凋亡比例明显高于对照组与空载体转染组;免疫荧光和western blot结果均表明AKT、p-AKT、Ki67、Bcl-2几个重要癌蛋白的表达水平均有明显的下调。
　　 重组腺病毒质粒表达载体rAd5-siAKT1-siPI3K介导的靶向AKT1,PI3KP85亚基的shRNA可以有效敲低AKT1、PI3Kp85表达水平。下游相关因子PCNA、CyclinD1表达下调,P53表达则上调。MTT法分析显示rAd5-siAKT1-siPI3K转染组胞生长抑制率＞50％,流式细胞术分析结果显示出现G0/G1细胞周期阻滞。2-Dmatrigel基质生长实验表明细胞贴壁生长能力明显减低,3-Dmatrigel基质生长实验显示rAd5-siAKT1-siPI3K转染组细胞形成的细胞团块较小。
　　 探讨以PAMAM为载体介导。miR-21抑制剂联合紫杉醇的抑瘤作用。联合治疗组细胞半数抑制浓度(IC50)从600nmo/L降低到80nmo/L;MTT结果表明联合治疗组细胞增殖率显著降低,流式细胞仪表明细胞凋亡比例显著升高,细胞周期的G0/G1期和S期均被阻滞;Transwell法检测联合治疗组细胞体外侵袭能力显著下降。Western blot结果表明EGFR、p-AKT、STAT3、p-STAT3、BcL-2、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均有明显的下调,而PTEN和Caspase-3的表达则明显上调。证明PAMAM介导miR-21抑制剂联合紫杉醇对乳腺癌的生长具有明显的抑制作用,可以成为治疗乳腺癌细胞的新策略。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 PI3K/AKT信号转导通路在恶性肿瘤中的研究进展

1.2.1 PI3K基因

1.2.2 AKT基因

1.2.3 PI3K/AKT信号转导通路在乳腺癌中的研究现状

1.3 基因治疗

1.3.1 基因治疗的概念

1.3.2 基因治疗的分类

1.3.3 RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)

1.3.4 微RNA技术(microRNA)

1.4 乳腺癌的基因与化疗的联合治疗

1.4.1 乳腺癌的常用化疗药物:紫杉醇

1.4.2 乳腺癌的基因与化疗的联合治疗

1.5 本论文工作的提出

第二章 RNAi抑制PI3Kp85a蛋白活性对人乳腺癌细胞系MCF-7生长抑制的体外研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 仪器和试剂

2.2.2 PI3kp85α siRNA靶序列的选择与合成

2.2.3 细胞培养及实验分组

2.2.4 基因转染

2.2.5 Realtime PCR检测P13Kp85 mRNA的表达

2.2.6 Western blot检测相关蛋白表达

2.2.7 免疫荧光检测蛋白原位表达

2.2.8 MTT法分析细胞增殖活性

2.2.9 流式细胞技术仪分析细胞周期

2.2.10 Anexin V检测细胞凋亡比例变化

2.2.11 Transwell检测体外侵袭

2.2.12 统计学处理

2.3 结果

2.3.1 Realtime PCR检测RNA干涉后目的基因的表达

2.3.2 Western blot观察RNAi后相关蛋白表达的变化

2.3.3 免疫荧光检测转染P13KP85α siRNA后蛋白表达变化

2.3.4 MTT法检测细胞增殖活性

2.3.5 Anexin V检测细胞凋亡

2.3.6 流式细胞术分析细胞周期

2.3.7 Transwell体外侵袭实验

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 RNAi抑制AKT蛋白活性抑制UCF-7人乳腺癌细胞生长的体外研究

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器和试剂

3.2.2 AKTsiRNA靶序列的选择与合成

3.2.3 细胞培养及实验分组

3.2.4 基因转染.

3.2.5 Realtime PCR检测AKT1 mRNA的表达

3.2.6 Western blot检测蛋白表达

3.2.7 免疫荧光

3.2.8 MTT法分析细胞增殖活性

3.2.9 流式细胞技术仪分析细胞周期

3.2.10 Anexin V检测细胞凋亡

3.2.11 Transwell体外侵袭实验

3.2.12 统计学分析处理数据

3.3 结果

3.3.1 Realtime PCR检测RNA干涉后目的基因的表达

3.3.2 Western blot观察相关蛋白表达的变化

3.3.3 免疫荧光法检测转染AKT siRNA后蛋白表达变化

3.3.4 MTT法分析细胞增殖活性

3.3.5 Anexin V检测细胞凋亡

3.3.6 流式细胞术分析细胞周期

3.3.7 Transwell体外侵袭实验

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 RNAi靶向AKT1、P13KP85α联合基因治疗抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的体外研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 仪器和试剂

4.2.2 细胞培养与实验分组

4.2.3 基因转染

4.2.4 Realtime PCR检测PI3Kp85α、AKT1 mRNA的表达

4.2.5 Western blot检测相关蛋白表达

4.2.6 MTT法分析细胞增殖活性

4.2.7 流式细胞术分析细胞周期

4.2.8 2-D Matrigel基质生长实验

4.2.9 3-D Matrigel基质生长实验

4.2.10 统计学处理

4.3 结果

4.3.1 腺病毒转染效率测定

4.3.2 Realtime PCR检测应用RNAi后目的基因mRNA的表达

4.3.3 Western blot检测应用RNAi后目的基因及其相关因子的蛋白表达

4.3.4 MTT法分析细胞增殖活性

4.3.5 流式细胞术分析周期

4.3.6 2-D Matrigel基质生长实验

4.3.7 3-D Matrigel基质生长实验

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 紫杉醇在人乳腺癌细胞系MCF-7中IC50的测定

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 仪器和试剂

5.2.2 细胞培养与紫杉醇溶液的配置

5.2.3 实验分组

5.2.4 MTT法测定紫杉醇在人乳腺癌细胞系MCF-7中IC50的测定

5.2.5 统计学方法

5.3 结果

5.3.1 不同浓度梯度紫杉醇溶液对人乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用

5.3.2 紫杉醇在人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中的IC50测定

5.4 讨论

5.5 本章小结

第六章 miRNA-21抑制剂联合紫杉醇抑制人乳腺癌细胞系MCF-7生长的体外研究

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 仪器和试剂

6.2.2 细胞培养与实验分组

6.2.3 MTT法分析细胞增殖活性

6.2.4 Anexin V检测细胞凋亡

6.2.5 流式细胞术分析细胞周期

6.2.6 Transwell法检测细胞侵袭能力

6.2.7 Western blot检测相关蛋白的表达

6.2.8 统计学方法

6.3 结果

6.3.1 细胞增殖活性的分析

6.3.2 Anexin V检测细胞凋亡

6.3.3 流式细胞术分析细胞周期

6.3.4 Transwell法检测细胞体外侵袭能力

6.3.5 Western blot检测相关蛋白的表达

6.4 讨论

6.5 本章小结

第七章 结论

参考文献

发表论文和科研情况说明

致谢