利用辅酶工程技术提高酿酒酵母木糖发酵生产乙醇能力

摘要

生物乙醇作为一种洁净的可再生能源,受到日益广泛的关注。木糖是自然界含量最丰富的五碳糖之一,广泛存在于林业及农业作物的半纤维素中,若能利用木糖生产生物乙醇,则会大大降低传统生物乙醇的生产成本。
　　酿酒酵母在乙醇生产方面有很多优势,但不能利用木糖,本课题组已将毕赤酵母木糖代谢的XYL1和XYL2基因导入到酿酒酵母中,构建出有木糖代谢能力的重组酿酒酵母菌株KAM-6X,由于木糖代谢过程中木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH分别依赖辅酶NADPH和NAD+,导致辅酶的不平衡,所以重组酿酒酵母中木糖-乙醇转化率较低。木糖代谢过程中消耗的NADPH主要由PPP途径的氧化还原阶段产生,并伴随生成CO2消耗了碳源;同时由于酿酒酵母内不含转氢酶,不能催化辅酶NADH和NADPH之间的相互转化。所以在本研究中,我们通过两种途径分别对重组酿酒酵母菌株的辅酶生成和转化方面进行改造:
　　首先:在重组酿酒酵母菌株中缺失PPP途径中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的基因zwf1,阻断此途径的NADPH生成,然后分别导入外源依赖NADP+的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPN和GDP1来替代zwf1基因产生NADPH,并且不生成CO2,但是混合糖发酵结果显示,缺失zwf1基因的酵母菌株基本不能利用木糖进行生长,说明zwf1基因在木糖代谢的PPP途径中具有关键作用,不能进行缺失。因此将GAPN和GDP1基因分别导入未缺失zwf1的重组酿酒酵母菌株KAM-6X和KAM-6X-NOXE中,其中GAPN基因分别用pPGK1、pHXT7、pFBA1启动子进行过表达,GDP1基因分别用pPGK1、pCCW12、pHXT7过表达,木糖的发酵结果显示:副产物木糖醇和甘油的产生减少,同时乙醇产率提高。说明木糖转化乙醇的能力增强,有更多的碳源向产生乙醇的方向流动,但是GAPN的重组菌株比GDP1的重组菌株在木糖发酵改善乙醇产量方面的效更加明显。
　　第二:在重组酿酒酵母中导入黑曲霉转氢酶基因NNT,将转氢酶NNT与荧光蛋白相偶联导入重组酵母中,通过观察荧光发现转氢酶NNT定位于线粒体中,然后分别用启动子pPGK1、pCCW12、pHXT7对基因NNT进行表达,构建出重组质粒转入酿酒酵母菌株KAM-6X中进行微好氧的木糖发酵,结果显示:甘油和木糖醇的产量降低,同时乙醇产率提高。
　　综上所述:通过导入外源GAPN和GDP1基因来弥补木糖代谢过程中第一步反应消耗的NADPH;导入转氢酶基因NNT来实现辅酶NADH和NADPH之间的相互转化,这些辅酶工程方法在提高酿酒酵母木糖代谢产生乙醇方面有积极的效果。

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第一章 文献综述

1.1 概述

1.2 本课题的研究背景

1.3 本文研究的背景、内容和目的

第二章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 发酵过程和色谱测定

第三章 外源NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对酿酒酵母木糖代谢的影响

3.1 概述

3.2 整合质粒的构建及酵母内源zwf1 基因的缺失

3.3 变异链球菌GAPN基因在重组酿酒酵母中的过表达及重组子的发酵

3.4 在酿酒酵母中过表达K.lactic的GDP1基因

3.5 本章小结：

第四章 黑曲霉的转氢酶NNT对酿酒酵母木糖发酵的影响

4.1概述

4.2 黑曲霉转氢酶NNT在酿酒酵母中的定位

4.3 转氢酶基因NNT对木糖发酵的影响

4.4 本章小结

第五章：总结与展望

5.1总结

5.2 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢