代谢物轮廓分析提高筑波链霉菌FK506产量

摘要

FK506是一种23元大环内酯类抗生素,可以由多种链霉菌合成。其免疫抑制的药效是环孢霉素A的10-100倍,目前是肝脏及肾脏移植后排斥反应的临床一线药物。此外,FK506还广泛应用于各种自身免疫病的治疗,被誉为未来十年内会对自身免疫疾病药物市场产生巨大影响的明星药物。然而FK506作为一种次级代谢产物,发酵周期长,产量低,导致分离难度大,成本高,严重制约了自身的医学应用和工业化生产。
　　到目前为止,提高FK506产量的手段依旧是传统的菌种诱变和基因工程。传统的诱变方法,具有很强的随机性和盲目性。虽然可在较短时间内大幅度地改变菌体的某些性状,但是缺乏理性思维,菌种突变的方向具有不确定性,需要大量的人力和资金投入;基因可以快速定位于胞内关键酶的改进,但是FK506作为一种次级代谢产物,高产机制非常复杂,影响因素繁多,仅仅针对某一部位的改造,很难从根本上提升FK506的产量。
　　为了解决以上难题,本研究利用初级代谢途径分子比较代谢轮廓学的方法,研究了筑波链霉菌胞内物质在FK506合成水平不同的两种培养基中的动态代谢过程及其差异。首先利用GC-MS等方法确定了胞内98种胞内物质,结合PCA和PLS多元统计方法,确定了甲基丙二酰CoA,莽草酸,琥珀酰CoA,丙酮酸,缬氨酸,脯氨酸,亮氨酸,乙酰CoA,4-磷酸赤藓糖,7-磷酸景天庚酮糖,苏氨酸,乳酸和丙二酰CoA共13种极关键性物质,这些物质来自中心碳代谢(EMP、PPP、TCA)、莽草酸途径和氨基酸代谢途径。将这13种物质同胞内物质具体代谢过程动态分析,发现发酵后期(144-192h),甲基丙二酰CoA、莽草酸供应不足(相对丰度=0),是导致FK506合成水平下降的原因。根据细胞代谢途径不足,通过前体添加及其组合优化最终提出了理性的强化策略。通过效果对比发现,在发酵168h时,FK506最终产量由251mg/L提高到了的405mg/L,同时FK520和FK520D分别下降了31％和39%。这种新型的理性优化策略,为当下提高生物质产品的产量提供了新的思路。

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第一章 文献综述

1.1 FK506概述

1.2 FK506产量提高的主要瓶颈

1.3 基于质谱的代谢组学及其主要应用

1.4 本课题的研究意义和研究内容

第二章 实验材料与方法?

2.1 实验材料

2.2 出发菌株筛选方法

2.3 培养基的动态检测

2.4 代谢轮廓学实验方法

2.5 前体的理性添加强化

2.6 实验的准确性设计

第三章FK506合成的关键代谢物和关键途径确定*

3.1 基于培养基动态检测揭示关键代谢物的理论分析

3.2 高产培养基(M2)与地产培养基(M1)发酵过程比较解析

3.3 培养基成分动态检测无法揭示关键因素的原因分析

3.4 代谢组学的必要性分析

3.5 利用代谢轮廓学确定胞内关键代谢物和代谢途径

3.6 筑波链霉菌关键代谢物和代谢途径的不足性分析

3.7 本章小结

第四章 代谢轮廓分析指导下的理性强化*

4.1 M2发酵特性理性强化

4.2 组合优化培养基M3发酵产物监测和强化效果验证

4.3 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 本文结论

5.2 创新点

5.3 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢