构建高效利用纤维二糖酿酒酵母的研究

摘要

同步糖化发酵在纤维素乙醇的生产中被广泛应用，但是在同步糖化发酵的过程中存在两个瓶颈问题：酶解过程中产生的纤维二糖抑制纤维素酶的活性；酿酒酵母的最适发酵温度与纤维素酶的最适温度不匹配。
　　在本研究中，表达纤维二糖转运蛋白（CDT）和β-葡萄糖苷酶（BGL）的基因被整合到酵母质粒pRS426上，将所得质粒pRS426-cdt-1-gh1-1导入到工业酿酒酵母SyBE001601中获得菌株SyBE001602。对菌株SyBE001602进行进化工程改造后得到菌株SyBE001603。与SyBE001602相比，SyBE001603的糖耗速率提高了1.8倍，达到2.35 g/L/h，乙醇产率提升了3.9倍，达到1.17 g/L/h，CDT的基因表达量提升了5.74倍，BGL的基因表达量提升了0.21倍。将CDT与BGL的基因在五个实验室底盘菌株中进行过表达以研究CDT与BGL的基因表达量对菌株纤维二糖利用能力的影响，发现过表达CDT与BGL的基因都会提高菌株的纤维二糖利用能力，但是提高的程度与底盘菌株的基因背景有关。
　　对菌株 SyBE001603的发酵性能进行表征，发现菌株在38℃条件下纤维二糖利用速率与30℃条件下利用速率基本一致，在34℃条件下菌株具有最高的发酵速率，在42℃条件下依然可以在30小时内将糖耗完。当纤维二糖浓度为80 g/L时，在34℃条件菌株的纤维二糖消耗速率可以达到3.67 g/L/h，在38℃条件仍可达到3.04 g/L/h。在pH为4.5的环境中菌株仍然可以正常生长，当pH大于5时菌株具有较快的生长速率。将菌株SyBE001603应用于同步糖化发酵中，可以发现同步糖化发酵过程中纤维二糖的积累被消除，纤维二糖对纤维素酶的抑制作用被解除，乙醇的产率显著提高，最终乙醇的得率提高了23％。
　　菌株SyBE001603对纤维素水解液中的抑制剂也具有一定的耐受能力。在纤维二糖作为单一碳源的条件下，菌株可以分别耐受3 g/L糠醛、1.5 g/L苯酚、4 g/L乙酸以及含有2 g/L糠醛、0.8 g/L苯酚、1.5 g/L乙酸的复合抑制剂，有望应用于工业生产中。

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前言

第一章 文献综述

1.1开发高效利用纤维二糖酿酒酵母菌株的必要性

1.2构建可利用纤维二糖酿酒酵母的研究进展

1.3本课题的研究思路及内容

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.2分子生物学技术

2.3发酵

2.4酶解与同步糖化发酵

2.5实时定量PCR

第三章 纤维二糖利用菌株的构建与表征

3.1可利用纤维二糖的工业菌株的构建

3.2进化工程对菌株纤维二糖利用的影响

3.3进化工程对关键基因相对表达量的影响

3.4纤维二糖代谢路径的理性优化

3.5小结

第四章 纤维二糖利用菌株的同步糖化发酵研究

4.1温度对菌株SyBE001603发酵的影响

4.2 pH对菌株SyBE001603发酵的影响

4.3同步糖化发酵

4.4小结

第五章 抑制剂对纤维二糖利用菌株发酵能力的影响

5.1糠醛对菌株发酵的影响

5.2苯酚对菌株发酵的影响

5.3乙酸对菌株发酵的影响

5.4复合抑制剂对菌株纤维二糖利用的影响

5.5小结

第六章 结论与展望

6.1结论

6.2创新性

6.3展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢