理性设计改造荧光素酶的热稳定性

摘要

与传统的化学催化剂相比，生物酶因具有特殊的优势，正在渐渐成为工业领域的主要工具。然而在工业生产苛刻的环境下，大部分生物酶不能够保持很高的活性。因此为了提高生物酶的工业价值，有必要通过蛋白质工程技术对其进行改造以提高热稳定性。北美萤火虫（Photinus pyralis）荧光素酶是一种高效催化生物发光反应的蛋白酶，具有极高的应用价值。然而野生型荧光素酶的热稳定性很差，37 ℃下，半衰期仅为2-3分钟，这在很大程度上限制了它在工业中的应用。
　　本研究以北美萤火虫荧光素酶作为研究对象，尝试利用一种新的理性设计方法RFSP（rigidify flexible sites through proline substitutions）提高其热稳定性。首先利用分子动力学模拟软件 Gromacs v4.5.5，几何模拟软件 FRODA以及获取B-Factor值的B-FITTER软件预测了荧光素酶结构内柔性区域Fragment471-481, Fragment487-495。然后结合β转角序列统计学信息以及引入位置原有的残基不参与形成氢键的原则确定了两个突变位点D476P和H489P，同时选取存在于非柔性区域的突变位点S307P作为对照。我们在大肠杆菌BL21（DE3）内成功构建了野生型荧光素酶重组载体（pET28a-luc），利用QuikChange定点突变方法引入三个突变位点，低温下进行诱导表达，利用镍离子亲和层析的手段纯化得到野生型及突变型荧光素酶。在对野生型及突变型荧光素酶的热稳定性，生物发光光谱，动力学常数测定后发现，H489P突变型的热稳定性提高了约1.5倍，同时活性以及生物发光光谱没有受到任何影响。
　　本研究首次提出了能有效提高蛋白质热稳定性的刚化柔性位点（rigidify flexible sites，RFS）的策略并将其成功应用于北美萤火虫荧光素酶，提高了北美萤火虫荧光素酶的热稳定性同时保持其活性不受影响。该策略有潜力应用于其他工业酶分子热稳定性改造，为进一步推进生物酶的工业化应用奠定了基础。

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第一章 绪论

1.1生物催化剂的热稳定性

1.2预测蛋白质柔性的方法

1.3刚化柔性位点的方法

1.4荧光素酶的热稳定性

1.5本研究的设计思路及意义

第二章 荧光素酶内柔性区域的预测及改造

2.1实验材料

2.2实验方法

2.3实验结果及讨论

2.4本章小结

第三章 荧光素酶突变体的载体构建及蛋白质分离纯化

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3实验结果及讨论

3.4本章小结

第四章 野生型与突变型荧光素酶结构及功能的研究比较

4.1实验材料

4.2实验方法

4.3实验结果与讨论

4.4本章小结

第五章 结论与展望

5.1主要结论

5.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况

附录

致谢